Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.
Gelişimsel ve çevresel ipuçları ca bitki hücrelerinde 2+ dalgalanmaları. Stimulus özgü mekânsal-zamansal Ca 2 + desenler Ca +2 sinyal kaskadlarını başlatmak hücresel Ca +2 bağlayıcı proteinler tarafından algılanır. Ancak, biz yine de belirli Ca 2 + sinyalleri üretilir uyaran nasıl hakkında biraz biliyorum. Ca 2 + sinyalinin özgünlüğü belirli bir uyarana cevap Ca 2 + kanalları ve / veya taşıyıcıların faaliyetlerinin sofistike regülasyonuna bağlı olabilir. Bu hücresel bileşenlerini belirlemek ve onların işlevlerini anlamak için, doku ve hücresel düzeydeki Ca 2 + sinyalleri hassas ve sağlam kayıt izin sistemleri kullanmak çok önemlidir. Farklı hücre bölmeleri hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri hücresel Ca 2 + sinyalleri canlı hücre konfokal görüntüleme için bir platform sağladı. Burada talimat tarifİki Ca 2 + algılama sistemlerinin kullanımı için s: FAS (film yapıştırıcı fidanları) ışıldama Ca 2 + görüntüleme ve case12 tabanlı canlı hücre konfokal floresan Ca 2 + görüntüleme bazlı Aequorin. Case12 kullanarak canlı hücre konfokal görüntüleme yüksek çözünürlükte sitozolik ve nükleer Ca 2 + sinyalleri aynı anda taranmasını sağlayan ise FAS sistemini kullanarak Lüminesans görüntüleme, doku seviyesinde mekansal ve zamansal Ca 2 + sinyalleri basit, sağlam ve duyarlı bir algılama sağlar.
Bitki hücresi, hücre hareketlerini koordine sinyalizasyonu ile çevreye göre. Çevresel uyarılara tepki olarak sinyal olayını erken hücre, bir geçici Ca 2 + artıştır. Serbest Ca2 + konsantrasyonu içindeki desen ya da geçici bir artış imzası, genliği, sıklığı ve süresi ile karakterize edilir. Farklı uzay-zamansal Ca 2 + imzalar farklı hücresel aktiviteler 1 düzenler. Sıcak, soğuk, tuz, kuraklık, ışık, veya bitki hormonları gibi belirli uyaranlara, ince ayar olabilir membran lokalize Ca 2 + kanalları ve / veya taşıyıcıların uzay-zamansal etkinliği, belirli Ca 2 + imzalar sonuçlanır. Ca 2 + taşıyıcıları, iyi karakterize edilmiş olmasına rağmen, küçük bitkilerde 1 Ca 2 + kanalları moleküler kimlikleri ve işlevleri hakkında bilinmektedir. Uyaranlara stres değiştirilmiş Ca 2 + tepki ile mutantlar için genetik ekranlar etkili olabilir yaklCa 2 + imzaları oluşturan bileşenleri belirlemek için oach. Son zamanlarda birçok Aequorin göre Ca +2 algılama sistemleri patojen saldırısı ve abiyotik stres 2-4 yanıt bileşenleri sinyalizasyon 2 + Ca genetik ekranlar kolaylaştırmak geliştirilmiştir.
Aequorin ilk 1990'ların başında 5 CA bitkilerde 2+ sinyalleri algılamak için kullanıldı. O zamandan beri, Aequorin Ca-2 belirli bir hücre izlemek için kök 8 tonoplast sitoplazma 5, 6 çekirdeği, kloroplastlar 7, 9 mitokondri ve stroma 10, yanı sıra farklı hücre tipleri gibi farklı hücresel bölümlerin, hedeflendi + sinyalleri 11. Aequorin tabanlı Ca 2 + ölçümleri uyaranlara stres hücrelerin bir nüfusun mekansal ve zamansal Ca 2 + tepkilerini ortaya çıkarmak. Bununla birlikte, çoğu durumda, tek hücreler Ca 2 + tepkileri vardır unsynchroniyanıt doku 4 zed. Bu nedenle, Aequorin Ca 2 + kayıt mutlaka bireysel hücrelerin Ca 2 + sinyalini bildirmiyor. Son yıllarda, genetik olarak kodlanmış floresan proteini (FP), yüksek çözünürlüğe sahip hücre içi Ca2 + sinyali incelemek için kullanılmıştır, CA böyle sarı cameleon (YÇS) 12 ve 13 olarak CASEs12 2 + göstergelerini tabanlı. YÇS flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) CFP ihtiva eden Ca2 + göstergeleri tabanlı ve YFP proteini kalmodulin ve kalmodulin-bağlanma peptidi M13 etmeye dayanır 2 + Ca ile bağlantılı varyantları bulunmaktadır. Ca2 bağlanan kalmodülin olarak bu şekilde daha yüksek enerji transferi (FRET geliştirilmiş) ile sonuçlanan, birbirine CFP ve YFP getiren, yapısal bir değişiklik olur. CFP sinyal yoğunluklarının için YFP oranı olarak yaklaşık olarak hesaplanan zaman, FRET düzeyi, hücre içi Ca2 + dinamiklerini göstermektedir. Çeşitli SK versiyonları tesislerinde kullanılmaktadır. YC3.6 t oldusitozolde 14,15, çekirdeğin 16, mitokondri 17 ve plazma zarı 18 ve YC4.6 ve D4ER için argeted ER 15,19 hedefleyen edildi ve D3cpv proksisomlara 20 hedeflenmiştir. YÇS sentezleyen transgenik bitkiler, farklı hücre tiplerinin farklı hücresel bölmeleri içinde Ca 2 + dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme sağlar. DAVALAR (muhtemelen Ca lcium se Nsor) bir kalmodulin ve kalmoduline bağlayıcı peptid M13 barındıran tek dairesel sırası büyük floresan proteinleri (cpFPs) vardır. Ca 2 + bağlanma üzerine, olgu floresan yoğunluğundaki bir artışa yol açan, konformasyonel değişiklikler yapılabilir. Kasanın floresan tepkisi ve Ca +2 konsantrasyonu arasında korelasyon hücre içi Ca + 2 dinamikleri kantitatif olarak ölçüldü sağlar. Case12 varyant 12 kat Ca 2 + -saturated formları floresan artmıştır. N benthiminana bitkilerin geçici olarak İfadeessing Case12 veya stabil bir şekilde eksprese eden Örneği 12 Arabidopsis bitkileri koruma ve abiyotik stres 4,21 Ca 2 sinyalini incelemek için kullanılmıştır. , Veya dehidrasyon strese patojen saldırısına yanıt hücrelerinde asenkron mekansal ve zamansal Ca 2 + salınımlar Case12 göre Ca 2 + görüntüleme ile ortaya konmuştur.
Burada, Arabidopsis fide 2+ dinamikleri Ca özel ve sitozolik konfokal görüntüleme ve nükleer Ca mendil ve uyaranlara Aequorin göre lüminesans görüntülemesi için ayrıntılı talimatlar sunmak FAS Vaka 12. Lüminesans görüntüleme ifade Arabidopsis kök hücrelerinde 2+ dinamikleri bozulmamış bitki ya da burada açıklanmayan dokularda stres ile indüklenen Ca2 + dinamiklerini analiz etmek için ya da 2 + sinyaller Ca etkisiyle değişmiş stres mutantlar için mutajenize bitki popülasyonlarını Arabidopsis taranması için adapte edilebilir. Canlı hücre Ca 2 + görüntüleme kurulum Ca analiz adapte olabilirCa 2 + Diğer göstergeler kullanılarak farklı bölmeler içinde subcelluar veya farklı hücre tiplerinde 2 + dinamiği.
Biz Arabidopsis fidelerinin mekânsal-zamansal Ca 2 + yanıt kayıt için FAS sistemi göstermiştir. Bu FAS Ca 2 + kayıt sistemi, CA burada sunulmuştur abiyotik stres uyarılara ek olarak çeşitli uyaranlar tarafından tetiklenen 2 + dinamiğini ölçmek için adapte edilebilir bir basit, hassas ve güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu sistemi kullanarak, kolayca bütün bitki düzeyinde doku ya da uyaranlara özgü mekânsal-zamansal Ca 2 + dinamiklerini karşılaş…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10X10 cm square petri dish | VWR | 60872-310 | |
adhesive film | VWR | 60941-062 | |
polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
1 mL syringe | VWR | 53548-000 | |
silicone grease | Beckman | 335148 | |
2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
ImageJ | NIH | N/A | Public domain, Java-based image processing program |
DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
All purpose Bleach | Any local store | N/A | |
Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
Agar | Sigma | A1296-5KG | |
Phytagel | Sigma | P8169-1KG |