Sinalização de Ca2 + regula diversos processos biológicos em plantas. Aqui apresentamos abordagens para monitorar o estresse abiótico induzida Ca espacial e temporal 2 + sinais em células e tecidos, utilizando os codificados geneticamente Ca2 indicadores aequorin ou case12 Arabidopsis.
Sinais ambientais e de desenvolvimento induzir oscilações de Ca2 + em células de plantas. Espaço-temporais de Ca2 + padrões específicos de estímulo são detectados por proteínas Ca2 + ligação celulares que iniciam Ca2 + cascatas de sinalização. No entanto, ainda sabemos pouco sobre como estímulo sinais de Ca 2 + específico são gerados. A especificidade de um sinal de Ca2 + pode ser atribuído à regulação sofisticados das actividades dos canais de Ca2 + e / ou transportadores, em resposta a um dado estímulo. Para identificar estes componentes celulares e compreender as suas funções, é essencial a utilização de sistemas que permitem a gravação sensível e robusto de sinais de Ca 2 + em ambos os tecidos e níveis celulares. Codificados geneticamente Ca2 indicadores que são direcionados para diferentes compartimentos celulares têm proporcionado uma plataforma para células vivas imagem confocal de celulares Ca2 + sinais. Aqui descrevemos instruçãos para a utilização de dois sistemas de detecção de Ca 2 +: aequorina baseado FAS (mudas adesivas película luminescência) de Ca2 + e de imagiologia case12 confocal de fluorescência de células vivas com base de Ca2 + de imagem. Imaging luminescência usando o sistema FAS fornece uma detecção simples, robusto e sensível de Ca2 + sinais espaciais e temporais em nível tecidual, enquanto células vivas imagem confocal usando case12 fornece detecção simultânea de citosólica e Ca2 + sinais nucleares em uma resolução alta.
A célula de planta responde ao meio ambiente através de sinalização que coordena as acções de células. Um evento de sinalização precoce de células em resposta a estímulos do meio ambiente é um aumento transitório de Ca2 +. O padrão, ou a assinatura de um aumento transitório da concentração de Ca2 + livre é caracterizado pela sua amplitude, frequência e duração. Assinaturas Ca2 + espaço-temporais distintas regular diferentes atividades celulares 1. Estímulos específicos, como o calor, o frio, o sal, a seca, a luz, ou hormônios vegetais, pode ajustar a atividade espaço-temporal localizada à membrana canais de Ca2 + e / ou transportadores, resultando em específicos de Ca2 + assinaturas. Embora os transportadores de Ca2 + têm sido bem caracterizados, pouco é conhecido sobre as identidades molecular e as funções de canais de Ca 2 + em plantas 1. Telas genéticos para os mutantes com alteração de Ca2 + resposta ao estresse pode ser um estímulo eficaz aproxoach para identificar os componentes que compõem Ca2 + assinaturas. Ca2 sistemas de detecção com base recentemente vários Aequorina têm sido desenvolvidos que facilitam telas genéticos para componentes de sinalização de Ca2 + em resposta a ataque patogénico e stress abiótico 2-4.
Aequorina foi usado pela primeira vez para detectar sinais de Ca2 + em plantas no início de 1990 5. Desde então, a Aequorina foi orientada para diferentes compartimentos celulares, tais como o 5 citoplasma, núcleo 6, 7 cloroplastos, tonoplast 8, 9 mitocôndrias, e estroma 10, bem como para diferentes tipos de células na raiz para monitorar célula específica de Ca 2 + sinais 11. Medições de Ca 2 + base de Aequorina revelar o espacial e temporal de Ca2 + resposta de uma população de células ao estresse estímulos. No entanto, na maioria dos casos, as respostas do Ca2 + de células individuais são unsynchronized no tecido respondendo 4. Por conseguinte, a Aequorina Ca2 + gravação não necessariamente comunicar o sinal de Ca2 + em células individuais. Nos últimos anos, a proteína fluorescente geneticamente codificado (FP) à base de Ca2 + de indicadores, tais como cameleon amarelo (YCS) 12 e 13 casos12 têm sido utilizados para estudar a sinalização de Ca2 + com alta resolução subcelular. YCS são fluorescência transferência de energia de ressonância (FRET) à base de Ca 2 + indicadores, contendo PCP e YFP variantes ligadas pela Ca2 + liga�o ao calmodulina proteínas e peptídeos de ligação à calmodulina M13. A calmodulina sofre uma alteração conformacional, uma vez que se liga a Ca 2 +, pondo assim PCP e YFP mais juntos, o que resulta num aumento da transferência de energia (reforçada FRET). O nível de FRET ao longo do tempo, calculada aproximadamente como a razão entre a intensidade do sinal YFP PCP, reflecte intracelular de Ca2 + dinâmica. Várias versões YC têm sido utilizados em plantas. YC3.6 era targeted para o citosol 14,15, núcleo 16, 17 mitocôndrias e membrana plasmática 18, e YC4.6 e D4ER foram direcionados para o ER 15,19, e D3cpv foi direcionada para os peroxissomos 20. Plantas transgênicas expressando YCS permitir a geração de imagens de células vivas de Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumivelmente Ca lcium se nsor) são proteínas simples permuta circular fluorescentes (cpFPs) abrigam uma calmodulina e peptídeos de ligação à calmodulina M13. Após a ligação ao Ca2 +, os casos sofrer alterações conformacionais, que conduz a um aumento da intensidade da fluorescência. A correlação entre a resposta da fluorescência do CASE e concentração de Ca2 + permite intracelular de Ca2 + dinâmica a ser medido quantitativamente. A variante case12 tem 12 vezes maior de fluorescência nas Ca2 + formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expressing case12 ou plantas de Arabidopsis expressando estavelmente Caso 12 foram usados para estudar Ca 2 + sinalização na defesa e abióticos de estresse 4,21. Asynchronous espacial e temporal Ca2 oscilações nas células respondem ao ataque de patógenos, ou ao estresse desidratação foram revelados com base case12 Ca2 + imagem.
Aqui, apresentamos instruções detalhadas para a Aequorina imagem luminescência base de Tecido e estímulos específicos Ca2 dinâmica em plântulas de Arabidopsis, e por imagem confocal de citosólica e Ca 2 + dinâmica nuclear em células das raízes de Arabidopsis que expressam Caso 12 luminescência de imagem de FAS pode ser adaptado para analisar induzidas pelo stress Ca2 dinâmica em plantas ou tecidos intactos não descritos aqui, ou para pesquisar populações de plantas de Arabidopsis mutantes por mutagénese com o stress alterado induzido Ca2 sinais. A configuração da imagem de células vivas de Ca2 + pode ser adaptado para analisar Ca2 + dinâmica em diferentes compartimentos subcelluar ou em diferentes tipos de células utilizando outros indicadores de Ca2 +.
Nós demonstramos um sistema FAS para a gravação do espaço-temporal de Ca2 + resposta de mudas de Arabidopsis. Este FAS Ca2 + sistema de gravação proporciona uma abordagem simples, sensível e robusto, que pode ser adaptado para medir a Ca2 dinâmica desencadeada por estímulos diversos, para além dos estímulos de stress abiótico, que são aqui apresentados. Usando este sistema, podemos facilmente comparar tecido- ou específicos de estímulos espaço-temporais Ca2 + d…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10X10 cm square petri dish | VWR | 60872-310 | |
adhesive film | VWR | 60941-062 | |
polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
1 mL syringe | VWR | 53548-000 | |
silicone grease | Beckman | 335148 | |
2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
ImageJ | NIH | N/A | Public domain, Java-based image processing program |
DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
All purpose Bleach | Any local store | N/A | |
Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
Agar | Sigma | A1296-5KG | |
Phytagel | Sigma | P8169-1KG |