Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.
Entwicklungs-und Umweltreize auslösen Ca 2 + Schwankungen in Pflanzenzellen. Reiz-spezifischen räumlichen-zeitlichen Ca 2 + Muster werden durch zelluläre Ca2 +-bindende Proteine, die Ca 2 +-Signalkaskaden initiieren abgetastet. Allerdings wissen wir noch wenig darüber, wie bestimmte Reiz Ca 2 +-Signale erzeugt. Die Spezifität eines Ca 2 +-Signal kann der ausgereiften Regulierung der Aktivitäten von Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure als Antwort auf einen gegebenen Reiz zurückzuführen. Diese Zellkomponenten zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Systeme, die eine empfindliche und stabile Aufnahme der Ca2 +-Signale sowohl auf dem Gewebe und zellulärer Ebene zu ermöglichen verwenden. Genetisch kodierte Ca 2 +-Indikatoren, die zu verschiedenen zellulären Kompartimenten richtet sind haben eine Plattform für Live Cell konfokale Bildgebung von zellulären Ca 2 +-Signale zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir Unterrichts für die Verwendung von zwei Erfassungssystemen Ca 2 +: Aequorin basierend FAS (Klebefilm Sämlinge) Ca 2 +-Lumineszenz-Bildgebung und case12 basierend Lebendzell konfokalen Fluoreszenz Ca 2 +-Bildgebung. Lumineszenz-Bildgebung mit der FAS-System bietet eine einfache, robuste und sensitive Detektion der räumlichen und zeitlichen Ca 2 +-Signale in der Gewebeebene, während Live Cell Imaging mit konfokalen Case12 bietet simultane Detektion von zytosolischen und Kern Ca 2 +-Signale mit einer hohen Auflösung.
Die Pflanzenzelle reagiert auf die Umgebung über die Signalisierungszelle Aktionen koordiniert. Ein frühes Zellsignalisierungsereignis als Reaktion auf Umweltreize ist eine vorübergehende Ca 2 + zu erhöhen. Das Muster oder der Signatur einer transienten Zunahme der freien Ca 2 +-Konzentration wird durch seine Amplitude, Frequenz und Dauer ist. Unterschiedliche Raum-Zeit-Ca 2 +-Signaturen regulieren verschiedene Zellaktivitäten 1. Spezifische Reize, wie Hitze, Kälte, Salz, Trockenheit, Licht oder Pflanzenhormone, kann eine Feinabstimmung des räumlichen und zeitlichen Aktivität des Membran-lokalisierten Ca 2 +-Kanäle und / oder Transporteure, was in bestimmten Ca2 +-Signaturen. Obwohl Ca 2 +-Transporter sind gut gekennzeichnet, ist nur wenig über die molekularen Identitäten und Funktionen der Ca2 +-Kanäle in Pflanzen 1 bekannt. Genetische-Mutanten mit veränderten Ca 2 + Reaktion auf Reize betonen, kann eine wirksame ca. seinoach für die Identifizierung der Komponenten, die Ca 2 +-Signaturen zu komponieren. Kürzlich mehrere Aequorin basierend Ca 2 + Detektionssysteme entwickelt, die genetischen Screens erleichtern für Ca2 + Signalkomponenten in Reaktion auf Krankheitserreger angreifen und abiotischen Stress 2-4.
Äquorin wurde zuerst verwendet, um in den frühen 1990er Jahren 5 Ca 2 +-Signale zu erkennen in Pflanzen. Seitdem hat Aequorin zu verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma 5, Kern 6, 7, Chloroplasten, tonoplast 8, 9 Mitochondrien und Stroma 10 sowie an verschiedenen Zelltypen in der Stammzell spezifische Ca 2 überwachen gezielt worden + Signale 11. Äquorin basierend Ca 2 +-Messungen zeigen, die räumliche und zeitliche Ca2 + Antwort einer Population von Zellen auf Reize zu betonen. In den meisten Fällen sind jedoch die Ca 2 +-Antworten einzelner Zellen unsynchroniim antwort Gewebe 4 zed. Daher Aequorin Ca2 + Aufnahme nicht unbedingt die Ca 2 +-Signal in einzelnen Zellen zu melden. In den letzten Jahren genetisch kodierte Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, wie gelb Cameleon (YCS) 12 und 13 CASEs12 verwendet worden, um Ca 2 + studieren Signalisierung mit hoher Auflösung subzellulärer. Ycs sind Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierenden Ca 2 +-Indikatoren, CFP und YFP-Varianten enthalten, durch die Ca 2 + gebunden bindende Protein Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Calmodulin eine Konformationsänderung wie sie Ca 2 + bindet, wodurch bewirkt CFP und YFP näher zusammen, was zu einem erhöhten Energie-Transfer (FRET verstärkt). Die FRET-Level über die Zeit, in etwa dem Verhältnis der an GFP YFP Signalintensitäten berechnet, spiegelt die intrazelluläre Ca 2 + Dynamik. YC mehrere Versionen in Pflanzen verwendet worden. YC3.6 war tin das Cytosol 14,15, 16 Kern, Mitochondrien 17 und 18 Plasmamembran und YC4.6 und D4ER argeted wurden in die Notaufnahme 15,19 gezielte und D3cpv wurde den Peroxisomen 20 ausgerichtet. Transgene Pflanzen, die YCS ermöglichen die Live-Cell-Imaging von Ca2 + Dynamik in verschiedenen zellulären Kompartimenten verschiedener Zelltypen. Fällen (vermutlich Ca lcium se nsor) sind Einzel zirkular permutierten fluoreszierende Proteine (cpFPs) beherbergen eine Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Nach der Bindung an Ca 2 +, Koffer unterziehen Konformationsänderungen, die zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Die Korrelation zwischen Fluoreszenzantwort der Fall und Ca 2 +-Konzentration ermöglicht die intrazelluläre Ca2 + Dynamik quantitativ gemessen werden. Die Case12 Variante hat 12-fach erhöht Fluoreszenz in den Ca 2 + -gesättigtem Formen. N. benthiminana Pflanzen vorübergehend ausdrEssing Case12 oder Arabidopsis-Pflanzen stabil exprimieren Fall 12 wurden verwendet, um Ca2 +-Signalisierung in der Verteidigung und abiotische Stress 4,21 studieren. Asynchrone räumliche und zeitliche Ca2 + Oszillationen in Zellen, die auf Pathogenbefall oder Austrocknung Stress haben mit Case12 basierend Ca 2 +-Bildgebung offenbart worden.
Hier präsentieren wir detaillierte Anweisungen für Aequorin Lumineszenz-Bildgebung von Gewebe-und Reize spezifischen Ca2 + Dynamik in Arabidopsis-Keimlinge, und für die konfokale Bildgebung von zytosolischen und Kern Ca 2 + Dynamik in Arabidopsis Wurzelzellen, die Fall 12. Lumineszenz-Bildgebung von FAS äußern könnten, die den Stress-induzierten Ca2 + Dynamik in ganzen Pflanzen oder Gewebe hier nicht beschrieben zu analysieren oder mutagenisierten Arabidopsis Pflanzenpopulationen nach Mutanten mit veränderten Stress induziert Ca2 +-Signale zu screenen. Die Lebendzell Ca2 + Imaging-Setup könnte angepasst Ca analysieren2 + Dynamik innerhalb verschiedener subcelluar Kammern oder in verschiedenen Zelltypen mit anderen Ca 2 +-Indikatoren.
Wir haben ein FAS-System zur Aufzeichnung der räumlichen-zeitlichen Ca2 + Antwort von Arabidopsis Keimlingen nachgewiesen. Diese FAS Ca 2 +-Aufzeichnungssystem ist eine einfache, empfindliche und stabile Ansatz zur Messung Ca2 + Dynamik durch verschiedene Stimuli neben den abiotischen Stressreize, die hier vorgestellt werden ausgelöst, angepasst werden kann. Mit diesem System können wir einfach vergleichen gewebespezifische Reize oder räumlich-zeitliche Dynamik Ca 2 + in d…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to B. Stevenson for technical assistance and Dr Marc R. Knight for providing Aequorin transgenic line. This work was funded by the National Institutes of Health Grant R01 GM059138.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
10X10 cm square petri dish | VWR | 60872-310 | |
adhesive film | VWR | 60941-062 | |
polyethylene tubing | PerkinElmer | 9908265 | |
1 mL syringe | VWR | 53548-000 | |
silicone grease | Beckman | 335148 | |
2-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155379 | |
8-well chambered cover glass | Nalge Nunc international | 155409 | |
luminescence imaging system | Princeton Instruments | N/A | |
inverted confocal laser-scanning microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon A1R |
Imaging software | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Elements |
ImageJ | NIH | N/A | Public domain, Java-based image processing program |
DataGraph | Visual Data Tools Inc | N/A | DataGraph 3.1.1 is the newest version |
coelenterazine | NanoLight Technolgies | #301B NF-BCTZ-FB | |
All purpose Bleach | Any local store | N/A | |
Triton X-100 | Fisher | BP151500 | |
MS salt | Phytotechnology Labs | M524-50L | |
sucrose | VWR | BDH8029-12KG | |
Agar | Sigma | A1296-5KG | |
Phytagel | Sigma | P8169-1KG |