Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano
Summary
O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.
Abstract
Um ensaio baseado em células vivo de sangue total citotoxicidade (WCA) que permite o acesso à informação temporal da citotoxicidade celular global é desenvolvida com a tecnologia de alto rendimento de posicionamento de célula. As populações de células tumorais alvo são primeiro pré-programado para imobilização num formato de array, e marcadas com corantes fluorescentes verdes citosólicas. Na sequência da formação de matriz celular, drogas de anticorpo são adicionados em combinação com sangue total humano. Iodeto de propídio (PI) é então adicionado para avaliar a morte celular. A matriz de células é analisado com um sistema de imagem automática. Embora as etiquetas corante citosólica populações de células tumorais visadas, as etiquetas PI populações de células tumorais mortas. Assim, a percentagem de morte de células de cancro alvo pode ser quantificada por cálculo do número de células sobreviventes direccionadas para o número de células alvo mortas. Com este método, os pesquisadores são capazes de acessar dependente do tempo e informações citotoxicidade celular dependente de dose. Notavelmente, sem rádio perigososprodutos químicos são utilizados. O WCA aqui apresentada foi testado com linfoma, leucemia e linhas celulares de tumores sólidos. Portanto, WCA permite aos pesquisadores para avaliar a eficácia da droga em uma condição altamente relevante ex vivo.
Introduction
Recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um aumento do interesse em realizar as identificações específicas de anticorpos contra as células do tumor e tratamentos personalizados de câncer; No entanto, vários obstáculos são encontrados no processo. Apenas 5% dos agentes que têm actividade anti-cancerígena em desenvolvimento pré-clínico são licenciados depois de mostrar eficácia suficiente em fase de testes II-III 1,2. As estratégias de pré-clínicos (tanto in vitro como in vivo) são sub-óptima como muitos exemplos têm mostrado que os medicamentos anti-tumorais se comportam de maneira diferente em humanos e em animais de laboratório, principalmente devido aos seus diferentes componentes do sangue de 3-5.
Para abordar a necessidade de uma plataforma de rastreio de drogas anti-tumor e para fornecer um ponto de verificação antes de experiências com animais e ensaios clínicos dispendiosa, um ensaio de citotoxicidade de sangue total humano (WCA) é proposto para avaliar a eficácia do fármaco anti-tumoral num ambiente biológico mais relevante. Oensaio de citotoxicidade de sangue total pode ser utilizada para avaliar a resposta de células individuais de anticorpos e outros candidatos a fármacos no sangue humano inteiro.
A WCA é desenvolvido através da incorporação de tecnologia de alto rendimento posicionamento de células com alta taxa de transferência e de alto teor de imagem 6. Através da utilização de um sistema de imagem automatizado, o número de ambas as células vivas e mortas pode ser determinada com um elevado grau de precisão. Devido ao facto de que as células-alvo são imobilizadas no mesmo plano focal, WCA é capaz de fornecer uma análise quantitativa citotoxicidade em tempo real, sem a remoção de células vermelhas do sangue. Além disso, o sistema de imagem automática, oferece várias vantagens, como a que apenas as células-alvo que atingiram os critérios especificados (ex., Células com marcação fluorescente, e morfologia das células) são fechados e processados. Além disso, ele permite a produção de placas de 144 por dia. Consequentemente, esta capacidade de imagem e taxa de transferência permite um funcionamento de alta content e experiências de alto rendimento simultaneamente. Ao combinar WCA eo sistema de imagem automatizado, alto rendimento análise de citotoxicidade celular quantitativa pode ser alcançada dentro de um ambiente mais relevante biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA é uma crítica em ferramenta de triagem anti-câncer vitro com resolução única célula 12-16, idealmente utilizado após exames alvo tradicionais, como o CDC e ensaios ADCC 11/09, e antes de testes em animais pré-clínicos. Atualmente, alvo primário testes de rastreio, como CDC ou ensaios ADCC são todos realizados em uma mídia simplificado ou um sistema de buffer. No entanto, os candidatos de droga que mostram eficácia no sistema tampão simplificada estes nem sempre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos programa IMAT Instituto Nacional do Câncer do NIH para financiar este trabalho [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
