Real-time cytotoxiciteitsassays in humaan volbloed
Summary
De volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) is een cytotoxiciteit assay ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met fluorescentie microscopie en geautomatiseerde beeldverwerking. Hier beschrijven we hoe lymfoomcellen behandeld met een anti-CD20 antilichaam kan worden geanalyseerd real-time in humaan volbloed kwantitatieve cellulaire cytotoxiciteit analyse.
Abstract
Een live-cell based volbloed cytotoxiciteit assay (WCA), dat de toegang tot temporele informatie van de totale cel cytotoxiciteit laat is ontwikkeld met high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling. De beoogde tumorcel populaties eerst voorgeprogrammeerd immobilisatie in een array formaat en gelabeld met groen fluorescent cytosolische kleurstoffen. Na de cel matrix formatie, worden antilichamen drugs toegevoegd in combinatie met humaan volbloed. Propidium jodide (PI) toegevoegd aan celdood. De celmatrix wordt geanalyseerd met een automatische beeldvormingssysteem. Terwijl cytosole kleurstof etiketteert de beoogde tumorcel populatie, PI labelt de dode tumorcel populaties. Aldus kan het percentage van kanker doelwit celdoding gemaakt worden door het aantal overlevende doelcellen om het aantal dode doelcellen. Met deze methode, de onderzoekers in staat zijn om toegang te krijgen tot tijdsafhankelijke en dosis-afhankelijke cel cytotoxiciteit informatie. Opmerkelijk, geen gevaarlijke radiochemicaliën. De WCA hier gepresenteerde is getest met lymfoom, leukemie en solide tumor cellijnen. Daarom WCA stelt onderzoekers in staat om de werkzaamheid van geneesmiddelen te evalueren in een zeer relevante ex vivo toestand.
Introduction
Recente vooruitgang in de farmaceutische industrie heeft geleid tot een toenemende belangstelling realiseren van de specifieke identificatie van tumorcellen antilichamen en gepersonaliseerde kankerbehandelingen; zijn echter een aantal belemmeringen bij het proces. Slechts 5% van de middelen die antikanker activiteit in preklinische ontwikkeling heeft zijn licentie na het tonen van onvoldoende werkzaamheid in fase II-III testen 1,2. De preklinische strategieën (zowel in vitro en in vivo) suboptimaal vele voorbeelden blijkt dat antitumorgeneesmiddelen zich anders gedragen in menselijke en in proefdieren vooral door hun verschillende bloedcomponenten 3-5.
Om de noodzaak van een anti-tumor drug discovery platform te pakken en om een check-point voor dure dierproeven en klinische proeven te verschaffen, is een humaan volbloed cytotoxiciteit assay (WCA) voorgesteld voor de evaluatie van anti-tumor werkzaamheid van het geneesmiddel in een meer relevante biologische omgeving. Hetvolbloed cytotoxiciteit assay kan worden gebruikt om de respons van de individuele cellen om antilichamen en andere geneesmiddelkandidaten in humaan volbloed evalueren.
De WCA wordt ontwikkeld door het opnemen van high-throughput cell technologie voor plaatsbepaling met high-throughput en high-inhoud imaging 6. Door gebruik van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, kan het aantal van zowel levende en dode cellen te bepalen met een hoge nauwkeurigheid. Vanwege het feit dat de doelcellen worden geïmmobiliseerd op dezelfde focal plane, WCA kan kwantitatieve analyse cytotoxiciteit in realtime verschaffen zonder het verwijderen van rode bloedcellen. Bovendien is het automatisch afbeeldingssysteem verschaft verscheidene voordelen zoals dat alleen doelcellen dat de opgegeven criteria bereikt (bijv., Fluorescent gelabelde cellen en celmorfologie) worden afgesloten en verwerkt. Ook maakt de productie van 144 platen per dag. Bijgevolg deze imaging mogelijkheden en doorvoer maakt werking van high-cNHOUD en high-throughput experimenten gelijktijdig. Door het combineren WCA en het automatische beeldvormingssysteem kunnen hoge throughput kwantitatieve cel cytotoxiciteit analyse worden verwezenlijkt in een biologisch relevante omgeving.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA is een cruciaal in vitro anti-kanker screening tool met enkele cel resolutie 12-16, idealiter gebruikt na de traditionele doelgroep screenings zoals CDC en ADCC testen 9-11, en voordat preklinische dierproeven. Momenteel, zijn primaire doel screening assays zoals CDC of ADCC testen allemaal uitgevoerd in een vereenvoudigd medium of een buffersysteem. Echter, kandidaat-geneesmiddelen die werkzaamheid vertonen in deze vereenvoudigde buffersysteem zijn niet altijd effectief in de co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken National Cancer Institute IMAT programma van NIH voor de financiering van dit werk [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
