Целью данной публикации является визуализация и обсудить оперативные шаги для улучшенного протокола Северная пятно на РНК, выделенной из Дрозофилы эмбрионов, клетки и ткани. Этот протокол является особенно полезным для эффективного обнаружения мелких видов РНК.
В последние десятилетия мы стали свидетелями взрыва научного интереса вокруг механизмов контроля экспрессии генов на уровне РНК. Эта отрасль молекулярной биологии была значительно подпитывается открытием некодирующих РНК в качестве основных игроков в пост-транскрипционной регуляции. Такая революционная перспектива сопровождается и вызвано развитием мощных технологий для профилирования короткий выражение РНК, как на уровне высокой пропускной (генома идентификации) или как одного кандидата анализа (стационарного накопления конкретных видов). Хотя несколько состояние дел в области стратегии в настоящее время доступны для дозирования или визуализации таких бегущих молекулы, Северная Клякса анализ остается право подход в молекулярной биологии для немедленного и точного вычисления выражения РНК. Она представляет первый шаг к применению более сложных, дорогостоящих технологий и, во многих случаях, остается льготный способ легко получить представлениев РНК биологии. Здесь мы обзору эффективный протокол (Enhanced Северная Клякса) для обнаружения слабо выраженные микроРНК (или других мелких нормативные вид РНК) из Дрозофилы целые эмбрионы, вручную расчлененный личинок / взрослых тканей или в пробирке культивируемых клетках. Очень ограниченное количество РНК не требуется, и использование материала, из проточной цитометрии-изолированные клетки могут быть также предусмотрены.
РНК биохимия пережил захватывающие прогрессирует в последние годы 1. Наша осмысление РНК потенциала в контроле экспрессии генов был лопнуть от идентификации мощных некодирующих рибо- регуляторов 2, в связи с открытием новых РНК на основе регуляторных механизмов 3,4 и более глубоким характеристик уже известных посттранскрипционных событий 5. Все вместе эти исследования позволили РНК биологии резко сделать сцену, став основным предметом исследования в современной научной ландшафта. В частности, за последние годы мы получаем ощущение всепроникающей влияния "мира РНК" на молекулярном нейробиологии 6, один из наиболее динамично развивающихся областей исследований в современной науке о жизни. В последнее десятилетие прошлого века, научная сценарий был революцию в связи с открытием в РНК-интерференция 7,8 и малых регуляторных РНК 9,10обращая особое внимание на микроРНК 11, эндогенно выразил небольшие некодирующих РНК участвует в контроле практически всех клеточных функций, как плейотропных и комбинаторных регуляторов экспрессии генов.
Почти через 10 лет после микроРНК первоначального открытия в Caenorhabditis Элеганс по Ambros и лабораторий Ruvkun в, повышенное внимание было обращено к области, когда большое число микроРНК были выявлены у дрозофилы и в клетках человека, а 12-15. С тех пор, благодаря универсальным трансгенных подходов, Дрозофилы выдалась как ценный биологическом контексте для углубляясь в микроРНК биосинтеза и деятельности. Drosophila микроРНК выявили различные функции в насекомых-специфических или эволюционно консервативных процессов, охватывающих от старения для метаболизма, сигнальных путей , поведение и, конечно, нейрогенез. Наряду этом направлении, мы недавно представила новый ссылку 16 в интригующей сотрудничестваrrelation происходит между мастер гена г см / скольжения и РНК пути. Коэффициент муха транскрипции GCM / Glide 17-19 представляет собой уникальный пример клеточной судьбы определителя, который диктует глиальных против нейронов выбор судьбы в мультипотентных летать нейронных предшественников 20. Двадцать год исследования по этой теме явно подчеркнул возникновение многочисленных и дублирующих друг друга входам регуляции экспрессии генов сходящийся над ГКМ / скользить 21-28 установить пороговые уровни, необходимые для балансировки нежную соотношение между нейронными и глиальных коллегами во время развития нервной системы.
Мы обнаружили, что регулирование с помощью DMEL-miR279 таргетинга представляет собой иной уровень управления, способствующий посттранскрипционных тонкой настройки гсм / скользить выражение 16. Во всем мире, эти направления исследований требуют от конкретные методологические усовершенствования: наряду лет, несколько технологий, первоначально разработанный для анализа традицitional РНК были преобразованы для количественного небольшие удобства РНК, кодирующие, вроде как анализов на защиту от РНКазы, кДНК массивов 29-31, ПЦР в реальном времени методов 32-35 и секвенирования 36,37. С другой стороны, калибровка технических подходов способствовала непрерывные прогрессирует в области.
Нозерн-блот анализ (NB, или РНК гель-блот-анализ) представляет репрезентативную экземпляр: она в значительной степени используется для профилирования накопление РНК, так как он обеспечивает как уровень экспрессии количественного а также определение размера. Тем не менее, внутренняя бедных чувствительность метода ограничивает, когда он должен быть применен к низкой обильных экспрессии генов тонких тюнеров, как коротких РНК. Вредным следствием является требование больших количеств суммарной РНК, которая затрудняет его применение в конкретных биологических образцах. По этим причинам, конкретных вариантов NB для малого обнаружения РНК были разработаны 38-40: мы воспользовались улучшенным NB прокedure 41 (ENB, Enhanced Северная Клякса), в то время как выяснения вышеуказанное взаимодействие между DMEL-miR279 и г см / скольжения.
Этот метод основан на шаге химической сшивки на основе активности производного карбодиимида [1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, EDC], чтобы зафиксировать нуклеиновой кислоты на твердых подложках. Карбодиимида является универсальным сшивани, как известно, катализируют образование амидных связей между активированными карбоксильными или фосфатных групп и аминогрупп 42. Это свойство может быть использовано для ковалентно пару малых РНК с помощью их моно-фосфорилируются 5'-гидроксильной группы до аминогрупп на поверхности нейлоновые мембраны. Полученную конфигурации крепления повышает доступность иммобилизованным нуклеиновой кислоты и, в свою очередь, эффективность гибридизации зонд-мишень, что приводит к повышению замечательной обнаружения 43.
Методика предполагает особое relevancе в Drosophila молекулярных исследований, с помощью которых возникновение новых и отличительных классов малых РНК некодирующих становится 44. Среди них, rasiRNAs 45,46 составляют особую подтип Piwi взаимодействующих РНК (пиРНК 47), участвующих в последовательности конкретных молчания генов. Оперативные Детали этого метода полностью описаны и визуализировали далее, по отношению к анализу микроРНК DMEL-miR279 и DMEL-miR286 и, в первый раз, одного rasiRNA, rasi4. Мы толкнул до крайности этот метод, который позволил нам выявить плохо выраженные цели с минимальным количеством РНК (менее 1 мкг).
Хотя наша оценка из усложняем сплетающего через который РНК регулирует нейрогенез постоянно растет, механистические последствия РНК на основе электрических схем, затрагивающих нервную биологию стволовых клеток, дифференцировку нейронов / функциональной интеграции, развитие нервны?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным институтом де ла Здоровье и де ла Recherche MEDICALE, Национальный центр де ла Recherche Scientifique, Университет Страсбурга, Hôpital де Страсбург, Ассоциация по ла Recherche сюр ле Рак, Национальный институт дю Рак, Agence Nationale-де-ла Recherche и региона Эльзас.
Пьетро LaNeve была поддержана Fondation Pour La Recherche MEDICALE. В настоящее время он является получателем Istituto Italiano Tecnologia (ИИТ) общения. Расходы на публикации поддерживаются сети Neurex (TriNeuron – Программа Interreg IV Рейн Верхний)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |