Lo scopo di questa pubblicazione è quello di visualizzare e discutere le fasi operative di un protocollo Northern Blot avanzata su RNA estratto da Drosophila melanogaster embrioni, cellule e tessuti. Questo protocollo è particolarmente utile per il rilevamento efficiente delle piccole specie di RNA.
Gli ultimi decenni hanno visto l'esplosione di interesse scientifico intorno a meccanismi di controllo dell'espressione genica a livello di RNA. Questa branca della biologia molecolare è stato notevolmente alimentata dalla scoperta di RNA non codificanti come principali attori regolazione post-trascrizionale. Tale prospettiva rivoluzionaria è stata accompagnata e innescata dallo sviluppo di tecnologie avanzate per la profilazione dell'espressione RNA breve, sia a livello di high-throughput (identificazione genome-wide) o come l'analisi singolo candidato (accumulo stato stazionario di determinate specie). Anche se diverse strategie state-of-art sono attualmente disponibili per il dosaggio o la visualizzazione di tali molecole in fuga, saggio Northern blot rimane l'approccio ammissibile in biologia molecolare per la valutazione immediata e precisa di espressione dell'RNA. Esso rappresenta un primo passo verso l'applicazione delle più sofisticate tecnologie, costose e, in molti casi, rimane un metodo preferenziale per guadagnare facilmente intuizioniin RNA biologia. Qui PANORAMICA un protocollo efficiente (Enhanced Northern Blot) per rilevare microRNA debolmente espresse (o altre piccole specie di RNA regolatori) da Drosophila melanogaster embrioni interi, sezionato manualmente tessuti / adulti larvali o in cellule coltivate in vitro. È necessaria una quantità molto limitata di RNA e l'uso di materiale dal flusso citometria cellule isolate possono essere anche previsto.
RNA biochimica ha sperimentato progressi spettacolari negli ultimi anni 1. La nostra comprensione del potenziale RNA nel controllo dell'espressione genica è stata scoppiata dall'identificazione dei potenti non codificanti Ribo-regolatori 2, dalla scoperta di nuovi a base di RNA-meccanismi regolatori 3,4 e da una caratterizzazione più profonda di eventi post-trascrizionali già noti 5. Tutti biologia dell'RNA insieme questi studi hanno permesso di rendere drammaticamente la scena, diventando un importante soggetto di ricerca nel panorama scientifico attuale. In particolare, negli ultimi anni stiamo ottenendo un senso di impatto pervasivo del "mondo RNA" in neurobiologia molecolare 6, uno dei settori di ricerca più dinamiche della moderna scienza della vita. Nell'ultimo decennio del secolo scorso, lo scenario scientifico generale è stata rivoluzionata dalla scoperta del RNA interference 7,8 e dei piccoli RNA regolatori 9,10con particolare riguardo alle microRNA 11, endogenamente espressi piccoli RNA non codificanti implicati nel controllo di quasi tutte le funzioni cellulari come regolatori pleiotropici e combinatorie di espressione genica.
Quasi 10 anni dopo la scoperta iniziale miRNA in Caenorhabditis elegans di Ambros e laboratori di Ruvkun, rinnovata attenzione è stata rivolta al campo quando un alto numero di miRNA sono stati identificati in Drosophila e in cellule umane e 12-15. Da allora, grazie ad approcci transgenici versatili, Drosophila melanogaster è distinto come un contesto biologico prezioso per approfondire miRNA biosintesi e di attività. Drosophila miRNA hanno rivelato funzioni distinte in processi specifici insetti o evolutivamente conservati, che vanno dall'invecchiamento al metabolismo, vie di segnalazione , il comportamento e, naturalmente, neurogenesi. Lungo questa direzione, abbiamo recentemente presentato un link romanzo 16 nella co intriganterrelation che si verificano tra il gene maestro GCM / planata e il percorso di RNA. Il fattore di trascrizione mosca Gcm / Glide 17-19 costituisce un esempio unico del destino delle cellule determinante, che condiziona la scelta destino neuronale gliale vs in multipotenti vola precursori neurali 20. Venti anni di lunghe ricerche su questo argomento ha chiaramente sottolineato la presenza di molteplici e sovrapposte ingressi di regolazione dell'espressione genica convergenti su gcm / glide 21-28 per stabilire i livelli di soglia richiesti per bilanciare il delicato rapporto tra controparti neuronali e gliali durante lo sviluppo neurale.
Abbiamo scoperto che la regolamentazione tramite DMEL-miR279 il targeting rappresenta un ulteriore livello di controllo che contribuiscono alla post-trascrizionale messa a punto di GCM / espressione 16 planare. Globalmente, queste linee di ricerca sono necessari miglioramenti metodologici specifici: lungo anni, diverse tecnologie sviluppate originariamente per analizzare tradRNA transitorie, sono stati convertiti per quantificare piccoli RNA non codificanti, come come saggi di RNase protection, array di cDNA 29-31, real-time PCR metodi 32-35 e sequenziamento 36,37. Dall'altro lato, ricalibrazione degli approcci tecnici ha favorito continui progressi nel campo.
Northern Blot test (NB, o gel RNA blot) costituisce un esempio rappresentativo: è in gran parte utilizzato per il profilo accumulo di RNA, in quanto garantisce sia a livello di espressione quantitativa nonché la determinazione dimensione. Tuttavia, la scarsa sensibilità intrinseca del metodo è limitante quando è applicato a bassa abbondanti espressione genica accordatori, come piccoli RNA. Una conseguenza dannosa è il requisito di grandi quantità di RNA totale, il che rende difficile la sua applicazione a campioni biologici specifici. Per tali ragioni, le varianti NB specifici per il rilevamento di piccoli RNA sono stati sviluppati 38-40: abbiamo approfittato di una migliore proc NBedure 41 (ENB, avanzato Blot Nord), mentre chiarire la suddetta interazione tra DMEL-miR279 e GCM / planata.
Questo metodo si basa su un gradino chimica di reticolazione basato sull'attività di un derivato carbodiimmide [1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide, EDC] fissare acido nucleico su supporti solidi. Carbodiimide è un linker croce versatile conosciuta per catalizzare la formazione di legami ammidici tra attivati gruppi carbossilici o fosfato e gruppi amminici 42. Questa proprietà può essere sfruttata per coppia covalentemente piccoli RNA attraverso il loro gruppo 5'-idrossile mono-amino fosforilata a gruppi sulla superficie delle membrane di nylon. La configurazione risultante attaccamento aumenta l'accessibilità dell'acido nucleico immobilizzato e, a sua volta, l'efficienza di ibridazione sonda-bersaglio, che si traduce in notevole miglioramento rilevamento 43.
La tecnica assume particolare relevance in studi molecolari Drosophila, dal quale, al verificarsi di nuovi e distintivi classi di piccoli RNA non codificanti sta emergendo 44. Tra questi, rasiRNAs 45,46 costituiscono uno specifico sottotipo di RNA-piwi interagenti (piRNAs 47), coinvolti nella sequenza-specifico silenziamento genico. Dettagli operativi di questo metodo sono descritti e visualizzati in appresso, relative all'analisi del DMEL microRNA-miR279 e DMEL-miR286 e, per la prima volta, di una rasiRNA, rasi4. Abbiamo spinto all'estremo questo metodo, che ci ha permesso rivelare bersagli poco espressi da quantità minime di RNA (meno di 1 mg).
Anche se il nostro apprezzamento per il sofisticato intreccio attraverso il quale l'RNA regola la neurogenesi è in continuo aumento, le implicazioni meccanicistiche di circuiterie di RNA che influenzano neurali biologia delle cellule staminali, differenziamento neuronale / integrazione funzionale, sviluppo di patologie neurali e tumori rimangono inesplorate. Il mantenimento di tali reti attraverso regni rende il potenziale dei sistemi genetici come Drosophila melanogaster strumentale per svelare vie cellul…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, il Centre National de la Recherche Scientifique, l'Université de Strasbourg, l'Hôpital de Strasbourg, l'Associazione pour la Recherche sur le Cancer, l'Institut National du Cancer, l'Agence Nationale de la Recherche e la regione dell'Alsazia.
Pietro Laneve è stata sostenuta dalla Fondation pour la Recherche Médicale. Attualmente, egli è destinatario di un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) borsa di studio. Spese di pubblicazione sono supportati dalla rete Neurex (TriNeuron – Programma Interreg IV Alto Reno)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |