A Novel<em> In vivo</em> Técnica Gene Transferência e<em> In vitro</em> Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

Summary

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Abstract

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Introduction

Doenças músculo-esqueléticas afectam milhões de pessoas nos Estados Unidos e apresentar conseqüências graves para os sistemas nacionais e locais de saúde ^1. Estes distúrbios são caracterizados por perda de massa óssea e da função articular que requerem tratamento extensivo e longos períodos de recuperação. Vulgarmente, um aumento relativo no número e / ou actividade dos osteoclastos, as células especializadas para reabsorver osso, na osteoporose e artrite observadas é ^2. Sob condições fisiológicas, o número e a actividade dos osteoclastos é regulada pelo activador do receptor do factor nuclear κ-B ligando (RANKL), o qual é produzido por osteoblastos. A osteoprotegerina (OPG), um receptor de engodo para RANKL também é produzido por osteoblastos ^três modelos animais in vivo que envolvem a sobre-expressão sistémica de sRANKL, ou deleção de OPG são muito valiosas na pesquisa de osteoporose.; No entanto, estes métodos requerem a geração de ratinhos transgénicos ^4,5. Aqui, uma nova alternativaMétodo de overexpressing sRANKL para o estudo de desordens relacionadas com musculoesqueléticas é descrito. Especificamente, minicírculo (MC) a tecnologia de DNA e métodos de entrega hidrodinâmicas foram utilizadas para conseguir a transferência do gene de sRANKL in vivo e sobre-expressar rato sRANKL sistemicamente ^6.

Este método também é complementar a outros modelos in vivo de osteoporose, tais como a modulação hormonal de osteoclastos seguintes ovariectomia ⁷ e a intervenção dietética com uma dieta pobre em cálcio ^8. Estes modelos são muito úteis para estudar os diferentes aspectos de distúrbios osteomusculares relacionados ao porém eles necessitam de procedimentos cirúrgicos e pode demorar até vários meses, a um custo significativo ^9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedor é um modelo animal experimental em que a remoção dos ovários leva à deficiência de estrogênio imitando assim osteoporose pós-menopausa humana ^10. Human osteoporose pós-menopausa, uma condição em que o estrogênio Deficiparência leva ao aumento do risco de fraturas ósseas e osteoporose afeta cerca de oito milhões de mulheres nos Estados Unidos. Embora o modelo de OVX é útil para a osteoporose pós-menopausa que oferece vantagens limitadas em estudar a osteoporose em geral. Estrogen suprime a perda óssea, induzindo a inibição de osteoclastos e osteoblastos apoptose, portanto, na sua ausência de um aumento da actividade dos osteoclastos é observada ^10-12. A relação de desequilíbrio RANKL-OPG que favorece a reabsorção óssea também é observada ^13. No entanto, a deficiência de estrogénio, in vivo, também é acompanhada por uma diminuição dos níveis de factor de crescimento transformante β (TGF β), o aumento da interleucina-7 (IL-7) e de TNF, IL-1 e IL-6, ^14,15. Como estas citocinas conhecidas funções moduladores de remodelação óssea independente da via de RANKL, é impossível atribuir qualquer activação dos osteoclastos unicamente ao eixo RANKL-RANK. O modelo descrito neste trabalho permite aos pesquisadores estudar em vivo eixo RANKL-RANK na osteoclastogênese e perda óssea sem citocinas pró-inflamatórias em comparação com modelos de roedores OVX.

Além disso, técnicas in vitro osteoclastogênese são ferramentas essenciais para estudar a ativação dos osteoclastos para potenciais tratamentos terapêuticos de doenças músculo-esqueléticas. Estudos anteriores também mostraram que a cultura de medula óssea do rato macrófagos derivados (BMMs) com o mouse macrófagos fator estimulador de colônias (M-CSF) e mouse sRANKL pode levar a diferenciação de osteoclastos ^3,16,17. Aqui, os protocolos de produção de células semelhantes a osteoclastos multinucleadas da medula óssea de rato, bem como a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro, ¹⁸ encontram-se descritos. Os ensaios baseados em células necessárias para definir um osteoclasto terminalmente diferenciadas e totalmente funcional madura também são descritas resumidamente. Estas técnicas in vitro complementar o romance em abordagem vivo e servem como pinstrumentos de investigação owerful para estudar a diferenciação dos osteoclastos e ativação. Utilizando estes sistemas, os cientistas são capazes de gerar os osteoclastos in vivo e in vitro e definir os estímulos e sinais necessários para a sua proliferação e activação, assim como testar a eficácia dos inibidores farmacológicos e biológicos.

Protocol

1. Entrega hidrodinâmica de sRANKL DNA MC Entrega hidrodinâmica via mouse cauda Veia Pesar o mouse antes da injeção veia da cauda. Diluir sRANKL ou proteína fluorescente verde (GFP) de MC em solução de Ringer (pré-aquecer a 37 ° C) em um volume total de ~ 10% do peso do corpo do rato. Aqueça o rato em uma gaiola por 10 min antes da injeção, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer nervuras laterais (VEs) visíveis. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação …

Representative Results

Aqui, uma técnica de transferência de gene novo para a diferenciação de osteoclastos in vivo e os protocolos de cultura de células para a diferenciação de células precursoras em osteoclastos in vitro, como um método para estudar os efeitos das citocinas em osteoclastogénese são descritos. Na Figura 1, os resultados representativos de transferência de gene bem sucedida da GFP e rato sRANKL MC em ratinhos são mostrados. Na Figura 2, as imagens representativa…

Discussion

Condições músculo-esqueléticas são as principais causas de morbidade e incapacidade e são compostas de mais de 150 doenças e síndromes; afetando cerca de 90 milhões de americanos hoje. Inflamação das articulações e destruição óssea são características predominantes de doenças músculo-esqueléticas, incluindo artrite e osteoporose. A osteoporose é uma condição que enfraquece a integridade óssea, muitas vezes levando a fraturas do osso. A artrite é uma doença crônica, debilitante doença caracte…

Materials

alpha-MEM	Life Technologies	12561-056
Human M-CSF	Miltenyi Biotec	130-096-492
Mouse M-CSF	Miltenyi Biotec	130-094-643
Human RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-631
Mouse RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice	Braintree	TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit	R&D systems	MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma	387A
MouseTRAP assay	immunodiagnostic systems	SB-TR103