Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
أمراض العضلات والعظام تؤثر على الملايين من الناس في الولايات المتحدة وعواقب وخيمة الحاضر على النظم الصحية الوطنية والمحلية 1. وتتميز هذه الاضطرابات بسبب فقدان العظام وظيفة مشتركة التي تتطلب معالجة مكثفة وفترات طويلة من الانتعاش. عادة، زيادة نسبية في عدد و / أو نشاط الخلايا الآكلة، وخلايا متخصصة ليرتشف العظام، في ترقق العظام والتهاب المفاصل لوحظ 2. في ظل الظروف الفسيولوجية وينظم عدد ونشاط الخلايا الآكلة بواسطة مستقبلات عامل منشط النووية κ-B يجند (RANKL)، الذي تنتجه الخلايا بانية العظم. Osteoprotegerin (OPG)، وينتج مستقبلات شرك لRANKL أيضا بانيات 3 في الجسم الحي النماذج الحيوانية التي تنطوي من overexpression النظامية من sRANKL، أو حذف OPG هي قيمة للغاية في مجال البحوث هشاشة العظام.؛ ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب جيل من الفئران المعدلة وراثيا 4،5. هنا، بديل الروايةيوصف أسلوب overexpressing sRANKL لدراسة الاضطرابات المرتبطة العضلات والعظام. على وجه التحديد، واستخدمت minicircle (MC) تكنولوجيا الحمض النووي وطرق التسليم الهيدروديناميكية لتحقيق نقل الجينات من sRANKL في الجسم الحي وoverexpress الماوس sRANKL جهازيا 6.
هذا الأسلوب هو أيضا مكملة للأخرى في الجسم الحي نماذج من ترقق العظام، مثل التشكيل الهرمونية من الآكلة التالية استئصال المبيض 7 والتدخل الغذائي من خلال اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم 8. هذه النماذج هي مفيدة جدا لدراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العضلية الهيكلية ذات الصلة إلا أنها تتطلب عمليات جراحية ويمكن أن يستغرق فترة تصل الى عدة أشهر، بتكلفة كبيرة 9. مستأصلة المبيض (وفك) نموذج القوارض هو نموذج على حيوانات التجارب حيث إزالة المبايض يؤدي إلى نقص هرمون الاستروجين بعد سن اليأس وهشاشة العظام وبالتالي محاكاة الإنسان 10. الإنسان بهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، شرط فيها هرمون الاستروجين deficiency يؤدي إلى زيادة خطر كسور العظام وهشاشة العظام يؤثر على ما يقرب من ثمانية ملايين امرأة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أن نموذج وفك مفيد لهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث أنه يوفر مزايا محدودة في دراسة هشاشة العظام بشكل عام. الاستروجين يمنع فقدان العظام، عن طريق حفز ناقضة العظم وتثبيط بناء العظم موت الخلايا المبرمج، وبالتالي في غيابها لوحظ زيادة النشاط ناقضة العظم 10-12. ويلاحظ وجود RANKL-OPG نسبة الخلل الذي يفضل ارتشاف العظام أيضا 13. ومع ذلك، ويرافق نقص هرمون الاستروجين في الجسم الحي أيضا من انخفاض مستويات عامل النمو تحويل β (TGF β)، وزيادة انترلوكين 7 (IL-7) وTNF، IL-1 و IL-6 14،15. لأن هذه السيتوكينات قد عرفت وظائف تغييري إعادة تشكيل العظام مستقلة عن المسار RANKL، فإنه من المستحيل أن ينسب أي تفعيل ناقضة العظم فقط إلى المحور RANKL رتبة. نموذج صفها في هذه الورقة تمكن الباحثون للدراسة في فيفس محور RANKL رتبة في osteoclastogenesis وفقدان العظام دون السيتوكينات الموالية للالتهابات مقارنة نماذج القوارض وفك.
بالإضافة إلى ذلك، في المختبر تقنيات osteoclastogenesis هي أدوات أساسية لدراسة تفعيل ناقضة العظم لعلاج العلاجية المحتملة للأمراض العضلات والعظام. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا أن زراعة نخاع العظم الضامة الماوس المستمدة (BMMs) مع الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) والماوس sRANKL يمكن أن تؤدي إلى التمايز ناقضة العظم 3،16،17. هنا، يتم وصف البروتوكولات لتوليد الخلايا ناقضة العظم مثل الماوس متعددة النوى من نخاع العظم وكذلك من الخلايا المحيطية وحيدات النوى الإنسان الدم (PBMCs) في المختبر 18. كما وصفها بإيجاز المقايسات خلية مقرها المطلوبة لتحديد ناقضة العظم متباينة عضال وتعمل بكامل طاقتها ناضجة. هذه في المختبر تقنيات تكمل الرواية في الجسم الحي والنهج معا بمثابة عأدوات التحقيق owerful لدراسة التمايز ناقضة العظم والتنشيط. باستخدام هذه الأنظمة، والعلماء قادرون على توليد الخلايا الآكلة في الجسم الحي في المختبر وتحديد المحفزات والإشارات اللازمة لانتشارها وتفعيل وكذلك اختبار فعالية مثبطات الدوائية والبيولوجية.
ظروف العضلات والعظام تقود أسباب الاعتلال والعجز وتتألف من أكثر من 150 من الأمراض والمتلازمات؛ التي تؤثر على ما يقرب من 90 مليون أميركي اليوم. التهاب المفاصل وتدمير العظام هي السمات الغالبة من الحالات العضلية الهيكلية، بما في ذلك التهاب المفاصل وهشاشة العظام. هشاشة الع…
The authors have nothing to disclose.
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |