Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
מחלות השלד והשרירים משפיעות על מיליוני אנשים בארצות הברית וההשלכות חמורות בהווה למערכות בריאות מקומיות וארציות 1. הפרעות אלו מתאפיינות באובדן העצם ותפקוד מפרקים הדורשים טיפול מקיף ותקופות של התאוששות ארוכות. בדרך כלל, גידול יחסי במספר ו / או הפעילות של osteoclasts, תאים מתמחים לנספגים שוב עצם, באוסטיאופורוזיס ובדלקת מפרקים שהוא ציין 2. בתנאים פיסיולוגיים במספר ובפעילות של osteoclasts מוסדר על ידי מפעיל הקולטן של הגורם הגרעיני κ-B ליגנד (RANKL), אשר מופק על ידי אוסטאובלסטים. Osteoprotegerin (OPG), קולטן דמה לRANKL מיוצר גם על ידי osteoblasts 3 בvivo מודלים של בעלי חיים הכרוכים בביטוי יתר מערכתי של sRANKL, או מחיקה של OPG יקרים מאוד במחקר באוסטאופורוזיס.; עם זאת, שיטות אלו דורשות הדור של עכברים הטרנסגניים 4,5. כאן, אלטרנטיבה רומןשיטה של overexpressing sRANKL לחקר הפרעות הקשורות לשרירים ושלד מתואר. באופן ספציפי, minicircle (MC) טכנולוגיית ה-DNA ושיטות משלוח הידרודינמית שימשו כדי להשיג העברת גנים של sRANKL in vivo ו overexpress עכבר sRANKL מערכתי 6.
שיטה זו היא גם משלימה in vivo מודלים אחרים לאוסטאופורוזיס, כגון אפנון הורמונלי של osteoclasts הבא ovariectomy 7 והתערבות תזונתית על ידי דיאטה דל בסידן 8. מודלים אלה הם מאוד שימושיים כדי ללמוד היבטים שונים של הפרעות הקשורות לשלד ושרירים עם זאת הם דורשים ניתוחים ועשויים להימשך עד מספר חודשים, במחיר משמעותי 9. מודל מכרסם ovariectomized (OVX) הוא מודל חיה ניסיוני שבו הסרת השחלות גורמת למחסור באסטרוגן ובכך מחקה אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אדם 10. אוסטיאופורוזיס בגיל הבלות אדם, מצב שבו defici אסטרוגןency מוביל לסיכון מוגבר לשברים בעצמות ובריחת סידן משפיעה על כשמונה מיליון נשים בארצות הברית לבדה. למרות שמודל OVX שימושי לאוסטיאופורוזיס בגיל הבלות הוא מציע יתרונות מוגבלים בלימוד אוסטאופורוזיס באופן כללי. אסטרוגן מדכא את איבוד מסת עצם, על ידי גרימת osteoclast ועיכוב אפופטוזיס osteoblast, ולכן בהעדרה פעילות osteoclast המוגבר הוא ציין 10-12. חוסר איזון יחס RANKL-OPG שמעדיף ספיגת עצם הוא ציין גם 13. עם זאת, מחסור באסטרוגן in vivo מלווה גם בירידה ברמות של הפיכת β גורם גדילה (β TGF), גדל אינטרלויקין 7 (IL-7) וTNF, IL-1 ו-IL-6 14,15. כציטוקינים אלה ידועים פונקציות ויסות שיפוץ עצם בלתי תלויות במסלול RANKL, אי אפשר לייחס כל הפעלת osteoclast אך ורק על ציר RANKL-RANK. המודל המתואר במאמר זה מאפשר לחוקרים ללמוד ביוo ציר RANKL-RANK בosteoclastogenesis ואובדן עצם ללא הפרו ציטוקינים דלקתיים בהשוואה למודלים של מכרסמים OVX.
בנוסף, טכניקות osteoclastogenesis במבחנה הן כלים חיוניים ללמוד הפעלת osteoclast לטיפולי פוטנציאל טיפוליים של מחלות השלד והשרירים. גם מחקרים קודמים הראו כי culturing מקרופאגים מח עצם עכבר נגזרים (BMMs) עם גורם מקרופאג העכבר מגרה מושבה (M-CSF) והעכבר sRANKL יכול להוביל לבידול osteoclast 3,16,17. הנה, את הפרוטוקולים כדי לייצר תאים כמו osteoclast-multinucleated ממח העצם של עכבר, כמו גם מהתאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) במבחנה 18 מתוארים. מבחני מבוססי התאים נדרשים להגדיר osteoclast הבדיל סופני ומתפקד באופן מלא בשלה גם מתוארים בקצרה. במבחנה טכניקות אלה משלימים את הרומן בגישת vivo ויחד לשמש pכלי החקירה owerful ללמוד בידול osteoclast והפעלה. שימוש במערכות אלה, מדענים מסוגלים לייצר osteoclasts in vivo ו במבחנה ולהגדיר את הגירויים ואותות הנדרשים להפצה וההפעלה שלהם, כמו גם לבחון את היעילות של מעכבים תרופתיים וביולוגיים.
תנאי השלד והשרירים מובילים גורמים לתחלואה ונכות ומורכבים של מעל 150 מחלות ותסמונות; המשפיע על כ -90 מיליון אמריקאים היום. דלקת מפרקים והרס עצם הם תכונות העיקריות של תנאים שרירי שלד, הכוללים דלקת מפרקים ואוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס היא מחלה שמחלישה את שלמות עצם, לעתים ?…
The authors have nothing to disclose.
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |