Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
El proceso de endocitosis mediada por clatrina (CME) depende de la llegada oportuna de los muchos componentes de la maquinaria endocítica mediada por clatrina para recoger y manipular la carga de la membrana plasmática en las vesículas 1-3. CME es iniciada por proteínas de deformación de la membrana y del adaptador de carga que se unen en sitios nacientes de endocitosis 1. Estas proteínas reclutan la proteína de la cubierta de clatrina, que se ensambla en una estructura en forma de jaula que forma la fosa revestidas de clatrina (CCP) 4. Una vez que el CCP está completamente montado en una forma esférica, la escisión de la membrana, principalmente a través de la acción de la gran GTPasa, dynamin, genera vesículas revestidas de clatrina libres (CCV) 5,6. Esta internalización desencadena un rápido desmontaje de la capa de clatrina, lo que permite a los componentes ser reutilizados para múltiples rondas de CME.
El descubrimiento y caracterización de las proteínas implicadas en CME se ha basado en Bioch tradicional, y las técnicas de microscopía genéticos emical 4-6,8. Estos ensayos han aclarado las funciones y puntos de interacción de estos componentes endocítica. Aunque muy útil para definir los componentes esenciales de la maquinaria de tráfico, estos ensayos son muy limitados en capturar el comportamiento dinámico de los componentes de CME o concentración de carga. Esta es una limitación crítica, ya que CME es impulsada por el conjunto coreografiado de conjuntos de módulos de la proteína en pasos definidos, y puesto que los pequeños cambios en la dinámica de los acontecimientos endocíticas individuales puede tener grandes consecuencias acumulativas sobre la endocitosis. Además, datos recientes indican que los PCC individuales pueden diferir tanto en la composición como en el comportamiento, lo que sugiere que la regulación fisiológica de este proceso es altamente espacial y temporalmente limitado 9-14. Visualización de eventos endocíticas individuales, por lo tanto, es esencial para entender por qué hay múltiples proteínas redundantes involucrados en CME y b cómo podrían controlarse estas proteínasseñales fisiológicas Y para regular la internalización de carga.
Aquí se describe el uso de Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) para observar CME en el nivel de la dinámica de los PCC individuales en las células vivas. TIRFM se basa en la diferencia en el índice de refracción entre el cubreobjetos de vidrio y el entorno fluido de células 15,16. Cuando la luz de excitación se dirige hacia las células en más que el ángulo crítico, se refleja internamente, creando una onda evanescente que mantiene un campo delgada de iluminación que se extiende aproximadamente 100 nm por encima del cubreobjetos. Esto garantiza que sólo las moléculas fluorescentes dentro de este estrecho campo están entusiasmados. Prácticamente, esto permite la excitación de las moléculas fluorescentes en o cerca de la membrana plasmática, y minimiza la fluorescencia de las partes interiores de la célula. Esto proporciona una relación señal-ruido y eje z significativamente mayor resolución para visualizar los eventos en la membrana plasmática, COmpared a los modos más comúnmente usados tales como epifluorescencia convencional o microscopía de fluorescencia confocal. También describimos, en una introducción y nivel práctico, el uso de una plataforma de análisis de imagen comúnmente utilizado para analizar y cuantificar características y dinámica de los acontecimientos endocítica de carga individuales morfológicos simples.
Aquí se describe el uso de TIRFM para visualizar la endocitosis mediada por clatrina (CME) a nivel de individuo PCC en las células vivas en tiempo real. CME es un evento rápido y muy dinámico mediada por el efecto acumulativo de muchos eventos espacial y temporalmente separados individuales. La mayoría de los ensayos que se utilizan actualmente, como las mediciones bioquímicas de internalización mediante biotinilación superficie o de unión del ligando, la citometría de flujo o ensayos de células fijas q…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |