Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית 1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק"ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר רכיבים לשימוש חוזר לסבבים רבים של CME.
הגילוי והאפיון של החלבונים המעורבים בCME כבר מושרשים בbioch המסורתיוטכניקות emical, גנטיות, מיקרוסקופיה 4-6,8. מבחני אלה הובהרו התפקידים ונקודות אינטראקציה של מרכיבי endocytic אלה. למרות שמאוד שימושי להגדרת מרכיבים חיוניים של מכונות סחר, מבחני אלה מוגבלים מאוד בלכידת ההתנהגות הדינמית של רכיבי CME או ריכוז מטען. זוהי מגבלה קריטית, שכן CME הוא מונע על ידי ההרכבה כוריאוגרפיה של קבוצות של מודולים חלבון בצעדים מוגדרים, וכן שינויים קטנים בדינמיקה של אירועי endocytic בודדים יכולים להיות השלכות מצטברות גדולות באנדוציטוזה. יתר על כן, הנתונים אחרונים מצביעים על כך שCCPs הבודד עשוי להיות שונה הן בהרכב ובהתנהגות, המצביעה על כך הרגולציה הפיזיולוגית של תהליך זה היא מאוד במרחב ובמוגבל 9-14 בזמן. לדמיין אירועי endocytic פרט, לכן, הוא חיוני כדי להבין מדוע יש חלבונים מרובים מיותרים מעורבים בCME וb איך אפשר לבקר את החלבונים האלהאותות פיסיולוגיים y להסדיר הפנמת מטען.
כאן אנו מתארים את השימוש בסך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) להתבונן CME ברמה של הדינמיקה של CCPs הבודד בתאים חיים. TIRFM מסתמך על ההבדל במקדם שבירה בין coverslip הזכוכית וסביבת הנוזל של תאי 15,16. כאשר אור העירור מכוון לתאים של יותר מ הזווית הקריטית, זה בא לידי ביטוי באופן פנימי, יצירת גל חולף ששומר על שדה דק של תאורה המשתרע כ 100 ננומטר מעל coverslip. הדבר מבטיח כי מולקולות הניאון רק בתחום צר זה שמחים. למעשה, זה מאפשר העירור של מולקולות ניאון על או ליד קרום הפלזמה, וממזער את הקרינה מחלקי הפנים של התא. זה מספק רזולוציה יחס וציר z אות לרעש גבוהה באופן משמעותי כדי לחזות אירועים בקרום פלזמה, שיתוףmpared למצבים נפוצים יותר כגון epifluorescence הקונבנציונלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. אנו גם מתארים, במבוא וברמה מעשית, השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה נפוץ לנתח ולכמת תכונות מורפולוגיות פשוטות ודינמיקה של אירועי endocytic המטען אישיים.
כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation מ…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |