Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.
Sakinleştikten ve çoğalması, kendini yenileme ve farklılaşmış döl üretimi arasında hassas bir denge sayesinde, hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin) tüm olgun kan hücresi soylarının ciro korumak. Belirli HSC kaderi açan karmaşık sinyallerin koordinasyon HKH'lerin ve hala anlaşılamamıştır karmaşık kemik iliği mikro, [1-2] arasındaki etkileşim dayanır.
Biz çok adım confocal ve in vivo görüntüleme teknikleri iki-foton ile istikrarlı hayvan konumlandırma için yeni geliştirilen bir örnek tutucu birleştirerek, yüksek çözünürlüklü 3D HSPCs içeren yığınları ve onların çevresindeki nişler elde etmek ve zamanla onları izlemek nasıl mümkün olduğunu açıklamak Çok noktalı time-lapse görüntüleme yoluyla. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tespit ex vivo olarak etiketlenmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) kemik iliği içinde ikamet verir. Dahası, multi-noktalı time-lapse 3D görüntüleme, odaha hızlı alma ayarları ile btained, HSPC hareket ve HSPCs ve stroma hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlar.
GFP pozitif osteoblastik hücrelerde ilgili olarak HSPCs takibi bu yöntemin örnek teşkil eden bir uygulama olarak gösterilmiştir. Bu teknik, fare kemik iliği calvarium mekan içinde herhangi bir ilgi, uygun şekilde etiketlenmiş, hematopoietik ve stromal hücre izlemek için kullanılabilir.
Kök hücre nişler gibi koku ampul, kas lifi, saç folikülü şişkinlik veya MSS subventricular 4-7 olarak yıllardır 3 tanınan ve de birçok dokuda karakterize edilerek rağmen hematopoetik kök hücreler (HKH'lerin) ve kemik iliği mikro arasındaki etkileşimler ( BM) için hala tam olarak bağlı kemiğe boyunca tek hücrelerin yanı sıra dokunun kendisinin çok sıvı gözlemlemek zor anlaşılır. Farklı hücre tipleri ve düzenleme sinyallerinin karmaşık bir ağ sükunet arasındaki dengeyi düzenlemekten sorumlu olduğunu, kesip çıkartma veya HSC ya da mikro-kendisi stromal hücreler içindeki belirli genlerin aşırı ifade göre fonksiyonel çalışmalarda da bir dizi aracılığıyla, gösterilmiştir , çoğalma, genişleme ve HKH'lerin 1-2 farklılaşması. HKH'lerin ve nişler arasındaki karışma yalnızca doğrudan gözlem yoluyla derinlemesine anlaşılabilir. Bu ach olduğunusadece mikroskopi açısından mevcut teknolojiyi birleştirerek gelişmiş görüntüleme protokollerinin gelişmesine ievable sayesinde, aynı zamanda numune tutucu çözümleri ve toplama yazılımı.
Fare kalvaryal kemiklerin BM bölmesine aktarılmıştır hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) tek hücre çözünürlüklü canlı görüntüleme aşılanması HSPCs daha olgunlaşmamış hücrelerin SDF-1 ve VCAM-1-pozitif damarların 8-9 yakınma ve bu lokalize olduğunu gösterdi onların döl 10 daha uzak ise GFP pozitif osteoblastik hücreler (osteoblast kısıtlı kollajen 1α promotör GFP sürücüler hangi Col2.3-GFP transgenik fare hattı,) 20 mikron – 15 içinde bulunur. Benzer gözlemler disseke ve kırık femur kemikleri 11'den ve inceltilmiş tibeal kemiklerden 12 elde edildi. Kalvarial kemik iliği Görüntüleme th içinde HSPCs doğrudan görselleştirme ulaşmak için en az invaziv bir yaklaşım kalırEIR yerli mikroçevresinin.
Herhangi bir canlı numune, görüntüleme ile, numune hareketi için gereksiz bozulmaları önlemek için mümkün olduğu kadar yine örnek tutmak için içsel bir ihtiyaç vardır. Nefes Kalvaryal kemik iliği görüntülerken kaçınılması gereken fare kafa salınım hareketleri neden olur. Onlar frontal kemiklerin engel çünkü beyin görüntüleme ve elektrofizyoloji örneğin kullanılan geleneksel stereotaktik sahipleri, kalvaryumun görüntüleme için uygun değildir. Canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji çalışmaları 13 sırasında sıkıntı en aza indirmek için kullanılan bir fare tutucu başlayarak, 2 komponent tutucu bir ile tutuş sağlayan büyük bir koluna bağlı bir görüntüleme penceresi oluşturmak için fare kafasına sabitlenen küçük bir parça ile geliştirilmiştir mikroskop sahne sıkıca tutan ağır taban plakası. Hala yerinde kafasını hareketsizleştirerek ve yeterli m ortadan kaldırırken, fare kafatası kafa parçasını emniyete ücretsiz nefes sağlarnefes nedeniyle Hareketleri. Tutucu gövdeye baş parçasını birbirine bağlayan "kilit ve anahtar" mekanizması penceresinin büyüklüğü bu nedenle ameliyat basitleştirilmesi, konumlandırma netliği kadar artan en aza sağlar, ve aşamaya taban plakasının uygun Mikroskop doğru hizalama için izin verir. Doğru hareketli hücreleri izlemek için, çok noktalı bir zaman atlamalı protokol süresi noktaları arasındaki 5 dk aralıklarla zamanla hücrelerin izlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Burada, etiketli MUYDUNUZ HKH'lerin col2.3GFP osteoblasitc muhabiri fareler 10,14 enjekte ve yaklaşık 20 saat sonra görüntülenmiş. Tasarlanmıştır ve birden fazla saatlik bir süre içinde aynı bölgelerde hızlı çok noktalı zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için gereken görüntüleme ayarları detaylı olarak tarif edilmektedir fare tutucu.
Ne gerçekleştirildi?
Bu protokol Fare kalvaryal kemik iliğinde arıtıldı FACS göçünü ex vivo etiketli nakledilen HSPCs izlemek için hızlandırılmış çok boyutlu görüntüleme kullanır. Tek nakledilen hücrelerin tanımlanması elde edilmiştir ve bu yüksek doğruluk ile zaman (saat) uzun süreler boyunca takip edilmiştir. Solunum kaynaklı hareket eserler minimize edilmiş ve hücreler tekrar tekrar uzun bir zaman boyunca reimaged edilmiştir.
Gelecek tarifi nedir?
Tekniğinin geliştirilmesi kısaltmak ve Not (fare kurtarma işlemini kolaylaştırmak için bir hafta veya daha fazla ve bu izofluran gibi gaz anestezik kullanımı boyunca, birden fazla gün görüntüleme için izin kurtarma deneylerde doğru ilerleme olabilir: Kurtarma deneyler kesinlikle gerektirir Steril cerrahi koşullar ve uygun analjezik uygulanması). DevBir in vivo boyaların daha büyük bir renk paleti yanı sıra, aynı zamanda, çok-etiketleme deneyleri kolaylaştırmak kemik iliği içinde hücre-hücre etkileşim daha fazla bilgi sağlar ve gelecekte daha karmaşık deneyler için sağlayacak hematopoietik hücrelerin etkili genetik etiketleme e Gelişim. Ayrıca, birden çok kemik iliği yapıları ve stroma bileşenlerinin eş zamanlı etiketleme HSPC nişler yer alan olayların bir daha tam bir resim sağlayacaktır. Hızlandırılmış filmlerin görüntü kararlılığı ayrıca stabilize edici mikroskop hem de görüntü tarihi algoritmaları kullanarak numune ve postacquisition sıcaklık gradyanları minimize preacquisition geliştirilebilir.
Sınırlamalar:
Açıklanan tekniği bazı sınırlamalar sunar. Enjekte edilebilir anestetiklerin uygulamasının ardından farelerin hayatta kalma süreleri önceden tahmin edilemez ve bu bireysel yanıtına bağlı olarak tecrübe komplikasyonlara çok kolayanestezik. Fare anestezi kurtarmak için ve fare ideal zaman atlamalı görüntüleme süresini sınırlayarak, tahsil edilecek olup olmadığını dikkatlice planlamak önemlidir genellikle, bir görüntüleme oturumu artık zordur. Enjekte anestezik kullanılması, her görüntüleme oturumda sürebilir zaman sınırlar. Bu anestezik küçük bir doz EÖ tarafından anestezi uzatmak mümkün olsa da, zor bu doğru ve fareyi doz aşımı in vivo görüntüleme erken fesih en sık nedenlerinden biridir gerçekleştirmek olduğunu. Izofluran> 2 saat uzun idare nadiren başarılı sonra gaz anestezi fare ancak hızlı iyileşme, daha az toksik ve daha uzun bir ilk görüntüleme oturumları için izin verir. Tekniğin diğer kısıtlılığı nedeniyle hızla görüntüler elde etmek için gerekliliğine, çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında elde edilebilir görüntülerin sınırlı çözünürlük. Fokal sürüklenme veya alanı ile birleştiğinde, (diski atlar) Yukarıdaki ussed, hücrelerin izleme zorlaştırabilir.
Alternatif yöntem Karşılaştırma:
HSPCs genellikle DiD lipofilik boya ile etiketlenmiş, ancak [16] gözden gibi DiR ve DII boyalar, eşdeğer alternatifler ve diğer hücre boyalar sürece yeterince parlak kullanılabilir vardır. Hücrelerin ex vivo etiketlendirmesi HKH'lerin uzun vadeli fonksiyonunu etkilemez gösterilmiştir olsak da, bu hücre bölünmesiyle seyreltildi ve neredeyse sınırlama (ya da herhangi bir başka kimyasal boya) sahiptir. HKH'lerin transplantasyonu izleyen ilk günlerde çoğalırlar yana, bu hücreler için gürültü oranı sinyal hızla bozulur. Genetik manipülasyon ve floresan proteinleri ifade ile hücrelerin etiketlenmesi endojen floresan proteinleri kafatası kemik yoluyla tespit edilebilir bir sinyal üretmek için yeterince yüksek seviyelerde ifade edilir sürece, uygulanabilir bir alternatif bir yöntemdir. Alternatif techn vardırMevcut iques kendi yararları ve sınırlamaları ile, kemik iliği alanı içinde her HSPCs görüntülenmesine gerçekleştirmek için. Konfokal görüntüleme cerrahi matkap ile tibia ve kemik minesinin incelmesi ekspojurlar takip ederken, fiber optik tabanlı görüntüleme cihazlarının yerleştirilmesi, uzun kemiklerde [8] kemik iliği sulandırma görüntüleme için izin [12] HSPCs ikamet detaylı görüntülerini üretti uzun kemiklerin çevresel alanları. Bununla birlikte, bu yöntemler, çok daha fazla invasif burada tarif edilen ve bu nedenle aynı fare içinde aynı kemik iliği alanda odaklanarak görüntüleme tekrar ederiz mani olandan bulunmaktadır. Ayrıca, bu teknikler geniş bir çevre dokuda hasar kaçınılmaz cevap veren gözlenen hücrelerini etkiler olasıdır. HSPCs kesilmiş, çatlak uyluk [11] üzerinde yer lamelleri ile kısa bir süre için görüntülenmiş olan, üzerine HSPCs doku bu sert, ancak hazırlama etkisi değil, Clear, ve teknik tek bir zaman noktasında elde etmek için gözlemler benzersiz kullanılmıştır. Sabit kemikler lekeli, seri bölüme ayrılır ve elde edilen görüntüleri damar atmalarını kullanılan, özellikle mükemmel 3D çözünürlük sağlayan bir 3D modeli yeniden inşa edilmiştir [17], ve son zamanlarda Lazer Tarama Cytometry (LaSC) kantitatif elde etmek için kullanılır olmuştur in situ HSPCs tedbirler hakkında, [18] immunboyama tarafından vurgulanan, ancak hücreler davranışları hakkında herhangi bir zamansal bilgi sağlayamıyoruz. Yeni yöntemin tarif edilen teknikler 4D hücrelerin izlenmesi için 3 boyutlu olarak iyi bir çözünürlük, yeterli geçici örnekleme bir kombinasyonunu sağlar ve bu nedenle, kemik iliği ile etkileşim HSPCs uzun süreli izleme elde etmek için ideal bir yaklaşım sağlar, göreceli olarak-invaziv mikroçevresinin.
The authors have nothing to disclose.
Görüntüleme Dr Martin Spitaler tarafından yönetilen Imperial College London FİLM tesis, içinde bulunan dik bir Leica SP5 konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirildi.
Numune tutucu ve miğfer Samuel Jones ve Dr Simon Schultz tavsiye ile, Imperial College London Kimya Mühendisliği departmanı ile işbirliği içinde yapıldı.
Nicola Ruivo Francisco Diaz ve Imperial College'da CBS personeli fare hayvancılığa onların yardım ve tavsiye için etkili oldular. Mark Scott CRUK, KKLF, BBSRC ve HFSP tarafından CRUK ve Cristina Lo Celso tarafından HFSP ve FİLM, Olufolake Akinduro tarafından finanse edilmektedir.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |