De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.
Door een delicate balans tussen rust en proliferatie, zelfvernieuwing en productie van gedifferentieerde nakomelingen hematopoietische stamcellen (HSCs) handhaven van de omzet van alle rijpe bloedcellen lineages. De coördinatie van complexe signalen leidt tot specifieke HSC lot berust op de wisselwerking tussen HSC en ingewikkelde beenmerg micro-omgeving die nog steeds slecht begrepen [1-2].
We beschrijven hoe een combinatie van een nieuw ontwikkelde monsterhouder voor stabiele dierlijke positionering meerstaps confocale en twee-foton in vivo beeldvorming, is het mogelijk om hoge-resolutie 3D stacks met HSPCs en hun omgevende niches en ze te tijdig te signaleren door middel van multi-point time-lapse imaging. High definition imaging laat het opsporen van ex vivo gelabeld hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPCs) die woonachtig zijn in het beenmerg. Bovendien, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained met snellere acquisitie instellingen, geeft nauwkeurige informatie over HSPC beweging en de onderlinge interacties tussen HSPCs en stroma cellen.
Tracking van HSPCs inzake GFP positieve osteoblastische cellen wordt getoond als een illustratieve toepassing van deze methode. Deze techniek kan worden gebruikt om elke gemerkte hematopoietische of stromale cellen van belang in de muis calvarium beenmerg ruimte volgen.
Ondanks stamcellen niches te zijn erkend voor tientallen jaren 3 en goed gekarakteriseerd in vele weefsels, zoals het reukorgaan, spiervezels, haarfollikel bobbel of CNS subventricular zone 4-7, de interacties tussen hematopoietische stamcellen (HSC) en beenmerg micro-omgeving ( BM) zijn nog slecht begrepen omdat het moeilijk direct te observeren enkele cellen door het bot en de zeer soepele aard van het weefsel zelf. Het is getoond, een aantal functionele studies gebaseerd op ablatie of door overexpressie van specifieke genen in zowel HSCs of de stromale cellen van de micro zelf, dat een ingewikkeld netwerk van verschillende celtypes en regulerende signalen verantwoordelijk voor het reguleren van het delicate evenwicht tussen rust , proliferatie, expansie en differentiatie van HSC 1-2. De overspraak tussen HSC en hun niches kunnen in de diepte alleen begrepen worden door middel van directe observatie. Dit is achievable dankzij de ontwikkeling van geavanceerde imaging protocollen, het combineren van de beschikbare technologie niet alleen in termen van microscopie, maar ook van de specimen houder oplossingen en van acquisitie software.
Single cell resolutie levende beeldvorming van getransplanteerde hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) in de BM compartiment van de muis schedeldak botten blijkt dat enting HSPCs lokaliseren in de nabijheid van SDF-1 en VCAM-1-positieve vaten 8-9 en meer onrijpe cellen gevonden binnen 15 – 20 micron van GFP-positieve osteoblastische cellen (Col2.3-GFP transgene muis lijn, waarbij de osteoblast beperkte collageen 1α promoter GFP-expressie) terwijl hun nakomelingen zijn distale 10. Soortgelijke waarnemingen werden verkregen uit ontleed en gebroken dijbeen botten 11 en vanaf uitgedund tibeal beenderen 12. Beeldvorming van calvarial beenmerg blijft de minst invasieve benadering van directe visualisatie van HSPCs binnen th bereikenMER inheemse micro-omgeving.
Met levende specimens beeldvorming is er een inherente noodzaak om de steekproef zo stil mogelijk te houden om onnodige artefacten als gevolg van sample verkeer te voorkomen. Ademhaling veroorzaakt oscillerende bewegingen van de muis hoofd, die moeten worden vermeden bij de beeldvorming calvarial beenmerg. Conventionele stereotactische houders, bijvoorbeeld gebruikt voor beeldvorming van de hersenen en de elektrofysiologie, zijn niet geschikt voor calvarium beeldvorming, omdat ze de voorhoofdsbeenderen belemmeren. Uitgaande van een muis houder gebruikt ongemak in levende imaging en elektrofysiologische studies 13 minimaliseren, werd een houder 2 componenten ontwikkeld, met een klein stuk naar de kop van de muis bevestigd aan een beeldvormende venster verbonden met een grotere arm waarborgen steady houden met creëren zware basisplaat die stevig is bevestigd aan de microscoop podium. Vastzetten van het kopstuk aan de schedel van de muis maakt vrije ademhaling terwijl het immobiliseren van het hoofd in plaats adequaat elimineren movements gevolg van de ademhaling. A lock-and-key "wetmatigheid hoofd-stuk naar het houderlichaam kan de grootte van het venster ook geminimaliseerd worden voor verhoogde nauwkeurigheid van de positionering derhalve vereenvoudiging van de operatie en de pasvorm van de basisplaat in het stadium accurate aanpassing aan de microscoop. Om beweeglijke cellen nauwkeurig te bewaken, werd een multi-point time lapse-protocol ontworpen om het bijhouden van de cellen mogelijk te maken in de tijd met 5 minuten intervallen tussen de tijdstippen. In casu heeft het label HSC worden geïnjecteerd in col2.3GFP osteoblasitc reporter muizen 10,14 en afgebeeld ongeveer 20 uur later. De muis houder die ontworpen en imaging instellingen waarbij snelle multi-point time-lapse imaging van dezelfde gebieden tijdens een periode van meerdere hr worden beschreven.
Wat werd bereikt?
Het protocol maakt gebruik van time-lapse multidimensionale beeldvorming om de migratie van FACS gezuiverd, ex vivo gemerkte, HSPCs getransplanteerd in muizen calvarial beenmerg controleren. Identificatie van afzonderlijke getransplanteerde cellen is verworven en deze werden gevolgd gedurende langere tijd (uur) met hoge nauwkeurigheid. Ademhaling geïnduceerde beweging artefacten zijn geminimaliseerd en de cellen zijn herhaaldelijk reimaged over een langere tijd-cursus.
Wat zijn toekomstige ontwikkelingen?
Ontwikkeling van de techniek kan ontwikkelen tot herstel experimenten toe te staan voor de beeldvorming over meerdere dagen, in de loop van een week of meer en gebruik van gas anesthetica, zoals isofluraan te verkorten en vereenvoudigen het herstelproces voor de muis (Let op: recovery experimenten vereisen strikt steriele chirurgische omstandigheden en de administratie van de juiste pijnstillers). Develing van een grotere kleur-palet in vivo kleurstoffen alsmede efficiënte genetische kenmerken van hematopoietische cellen ook multi-labeling experimenten vergemakkelijken, meer inzicht in cel-cel interacties in het beenmerg en zorgen voor meer complexe experimenten in de toekomst. Daarnaast zal gelijktijdige vermelding van meerdere beenmerg structuren en stroma componenten een completer beeld van de gebeurtenissen die plaatsvinden in HSPC niches bieden. Stabiliteit van het beeld van de time-lapse filmpjes kan worden verbeterd preacquisition door het stabiliseren van de microscoop verder evenals het minimaliseren van de temperatuur gradiënten in het monster en postacquisition door beeldregistratie algoritmen.
Beperkingen:
De beschreven techniek presenteert een aantal beperkingen. Overleving van muizen na toediening van injecteerbare anesthetica is onvoorspelbaar en is zeer eenvoudig te bieden complicaties afhankelijk van de individuele respons op deverdoving. In het algemeen, hoe langer een opnamesessie, hoe moeilijker is voor de muis om te herstellen van anesthesie en het is daarom belangrijk om zorgvuldig te plannen als de muis in te vorderen, idealiter het beperken van de duur van de time-lapse imaging. Het gebruik van injecteerbare anesthetica beperkt de tijd die elke opnamesessie kan duren. Hoewel het mogelijk is om de anesthesie te verlengen door opnieuw toedienen van de dosering van verdoving moeilijk voert deze nauwkeurig en overdosering de muis is een van de belangrijkste oorzaken van voortijdige beëindiging van in vivo imaging. Gas anesthesie is minder giftig en zorgt voor een langere eerste opnamesessie echter snel herstel van de muis na> 2 uur lang de toediening van isofluraan is zelden succesvol. Een andere beperking van de techniek is de beperkte resolutie van de beelden die worden verkregen bij multi-point time-lapse imaging, vanwege de noodzaak om beelden snel verwerven. Dit, in combinatie met focale afwijking of veld springt (discboven ussed), kan het volgen van de cellen moeilijk te maken.
Vergelijking met alternatieve methoden:
HSPCs worden gewoonlijk gelabeld met de lipofiele kleurstof deed, maar DiR en Dil kleurstoffen gelijkwaardige alternatieven en andere mobiele kleurstoffen kunnen worden gebruikt zolang als voldoende helder, zoals beoordeeld in [16]. Alhoewel ex vivo labeling van cellen met WIST is aangetoond dat geen invloed op de werking op lange termijn van HSCs, heeft de beperking dat DiD (of andere chemische kleurstoffen) wordt verdund op celdeling. Aangezien HSCs prolifereren gedurende de eerste dagen na transplantatie, de signaal-ruis verhouding voor deze cellen snel verslechtert. Endogene labeling van cellen door middel van genetische manipulatie en expressie van fluorescerende eiwitten een levensvatbaar alternatief werkwijze, zolang de fluorescerende eiwitten tot expressie bij voldoende hoge niveaus detecteerbaar signaal via schedelbeen genereren. Er zijn een aantal alternatieve techniques beschikbaar voor beeldvorming van HSPCs voeren binnen het beenmerg ruimte, elk met hun eigen voordelen en beperkingen. Inbrengen van glasvezel-gebaseerde beeldapparatuur toegestaan voor beeldvorming van het beenmerg reconstitutie in lange beenderen [8], terwijl de confocale beeldvorming na chirurgische blootstelling van het scheenbeen en het dunner worden van het bot emaille met een chirurgische boor [12] geproduceerd gedetailleerde beelden van HSPCs woonachtig in de perifere gebieden van de lange beenderen. Deze methoden zijn echter veel invasief dan de hier beschreven en derhalve niet toe om beeldvorming sessies gericht op dezelfde beenmerg stippellijn in dezelfde muis herhalen. Bovendien is het mogelijk dat deze technieken kunnen hebben op de waargenomen gezien de onvermijdelijke reactie op grote schade in het omringende weefsel cellen. HSPCs zijn afgebeeld gedurende korte tijd door dekglaasjes geplaatst over uitgesneden, gebroken dijbeen [11], maar de gevolgen van dit ruwe preparaat van het weefsel op HSPCs niet clear en de techniek uniek gebruikt keer puntwaarnemingen verkrijgen. Vaste botten zijn verdeeld in seriële secties, gekleurd, en de verkregen beelden gereconstrueerd in een 3D-model, met een uitstekende 3D-resolutie, vooral als vasculaire afgietsels worden gebruikt [17], en Laser onlangs Scanning Cytometry (LASC) is gebruikt voor het verkrijgen van kwantitatieve maatregelen over HSPCs in situ, benadrukt door immuunkleuring [18], maar zijn niet in staat om enige tijd informatie over de cellen gedrag. De in deze nieuwe techniek beschreven technieken bieden een combinatie van goede resolutie in 3D voldoende spreiding in voor de controle cellen in 4D en ze zijn relatief niet-invasieve, biedt daarom een ideale benadering langdurige bewaking van HSPCs bereiken interactie met het beenmerg micro-omgeving.
The authors have nothing to disclose.
Beeldvorming werd uitgevoerd op een rechtopstaande Leica SP5 confocale microscoop gelegen binnen de FILM faciliteit van het Imperial College in Londen, geleid door Dr Martin Spitaler uitgevoerd.
De monsterhouder en kopstuk werd gemaakt in samenwerking met de afdeling Chemische Technologie van het Imperial College in Londen, met advies van Samuel Jones en Dr Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz en CBS medewerkers aan het Imperial College waren instrumentaal voor hun hulp en advies op de muis en veeteelt. Mark Scott wordt gefinancierd door HFSP en FILM, Olufolake Akinduro door CRUK en Cristina Lo Celso door CRUK, KKLF, BBSRC en HFSP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |