Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.
Durch eine feine Balance zwischen Ruhe und Proliferation, Selbsterneuerung und die Produktion von Nachkommen differenziert, hämatopoetische Stammzellen (HSC) halten die Umsatz aller reifen Blutzelllinien. Die Koordination der komplexen Signale, die zu spezifischen HSC Schicksal beruht auf der Wechselwirkung zwischen HSCs und die komplizierte Knochenmark-Mikroumgebung, die noch wenig bekannt ist [1-2].
Wir beschreiben, wie durch die Kombination eines neu entwickelten Probenhalter zur stabilen Positionierung Tier mit mehrstufiger konfokalen und Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebungstechniken, ist es möglich, hochauflösende 3D-Stapel enthält HSPCs und ihrer Umgebung Nischen zu erhalten und sie im Laufe der Zeit zu überwachen durch Mehrpunkt-Zeitraffer-Bildgebung. High-Definition-Bildgebung ermöglicht Erfassung ex vivo markierten hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark wohnen. Darüber hinaus Multi-Point-Zeitraffer-3D-Bildgebung, omit schneller Erfassungseinstellungen btained, liefert genaue Informationen über HSPC Bewegung und die wechselseitigen Interaktionen zwischen HSPCs und Stromazellen.
Tracking HSPCs in Bezug auf GFP positive Osteoblasten als beispielhafte Anwendung des Verfahrens gezeigt. Diese Technik kann verwendet werden, um jede entsprechend markierten hämatopoetischen oder Stromazellen von Interesse innerhalb der Maus Schädelknochenmarkraum zu verfolgen.
Trotz Stammzellnischen mit 3 Jahrzehnten erkannt und auch, wie die Riechkolben, Muskelfaser, Haarfollikel Ausbuchtung oder ZNS Subventrikularzone 4-7 in vielen Geweben gekennzeichnet, die Interaktionen zwischen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) und Knochenmark-Mikroumgebung ( BM) sind immer noch schlecht wegen der Schwierigkeit der Beobachtung einzelner Zellen direkt durch den Knochen als auch die extrem flüssige Natur des Gewebes selbst verstanden. Es hat sich gezeigt, durch eine Reihe von Funktionsstudien auf der Basis Abtragen oder Überexpression bestimmter Gene entweder in HSCs oder den Stromazellen des Mikroumgebung selbst, dass ein komplexes Netzwerk verschiedener Zelltypen und Regelungssignale zum Regeln der empfindliche Gleichgewicht zwischen Ruhe verantwortlich , Proliferation, Expansion und Differenzierung von HSCs 1-2. Das Übersprechen zwischen HSC und ihre Nischen in der Tiefe nur durch direkte Beobachtung zu verstehen. Dies ist achievable dank der Entwicklung von fortschrittlichen Abbildungsprotokolle, die Kombination der Technik nicht nur in der Mikroskopie, sondern auch der Probenhalter-Lösungen und der Erfassungssoftware.
Einzelzellauflösung die Bildgebung von transplantierten hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) im BM Fach der Maus Calvaria Knochen zeigte, dass engrafting HSPCs lokalisiert in der Nähe von SDF-1 und VCAM-1-positiven Gefäße 8-9 und unreifer Zellen 20 Mikrometer von GFP-positiven Osteoblasten (Col2.3-GFP transgenen Mauslinie, in der der Osteoblasten-beschränkt Kollagen 1α Promotor treibt GFP-Expression), während ihre Nachkommen sind mehr distalen 10 – innerhalb von 15 gefunden. Ähnliche Beobachtungen wurden von seziert und gebrochenen Oberschenkelknochen 11 und von ausgedünnten Knochen tibeal 12 erhalten. Abbildung von Schädelknochenmark bleibt die am wenigsten invasive Ansatz zur direkten Visualisierung der HSPCs innerhalb th erreichenEIR nativen Mikroumgebung.
Mit jedem lebendes Exemplar Bildgebung gibt es eine inhärente Notwendigkeit, die Probe so ruhig wie möglich zu halten, um unnötige Artefakte durch Probenbewegung zu vermeiden. Atmung verursacht Schwingungsbewegungen der Maus den Kopf, die vermieden werden, wenn die Abbildung Schädelknochenmark müssen. Herkömmlichen stereotaktischen Inhaber, zum Beispiel für bildgebende und elektrophysiologische verwendet werden, sind nicht geeignet für die Bildgebung Schädeldach, weil sie behindern die Stirnknochen. Ausgehend von einer zur Not während der Live-Bildgebung und Elektrophysiologie Studien 13 minimieren Maushalterung wurde ein 2-Komponenten-Halter entwickelt, mit einem kleinen Stück an den Kopf der Maus fixiert, um ein bildgebendes Fenster zu einer größeren Arm verbunden ist gewährleistet sicheren Halt mit einem erstellen schwere Grundplatte, die fest in den Mikroskoptisch befestigt ist. Sicherung des Kopfteils auf den Schädel der Maus erlaubt die freie Atmung, während noch Immobilisierung der Kopf an Ort und Stelle und angemessen zu beseitigen movements aufgrund der Atmung. Ein "Schlüssel-Schloss-Schlüssel-Mechanismus verbindet das Kopfstück an dem Haltekörper erlaubt die Größe des Fensters, und minimiert eine erhöhte Positioniergenauigkeit, daher eine Vereinfachung der Operation und der Sitz der Grundplatte in die Stufe ermöglicht eine genaue Ausrichtung auf dem Mikroskop. Um bewegliche Zellen genau zu überwachen, wurde ein Multi-Point-Zeitraffer-Protokoll, das zum Verfolgen von Zellen im Laufe der Zeit mit 5-Minuten-Intervallen zwischen den Zeitpunkten zu ermöglichen. Hier tat beschriftet HSK sind in col2.3GFP osteoblasitc Reporter Mäusen injiziert 10,14 und ca. 20 Stunden später abgebildet. Die Maus Halter, entwickelt und die Bildeinstellungen erforderlich, um eine schnelle Mehrpunkt-Zeitraffer Abbildung der gleichen Bereiche über einen Zeitraum von mehreren Stunden durchgeführt werden detailliert beschrieben.
Was wurde erreicht?
Das Protokoll verwendet Zeitraffer mehrdimensionale Bildgebung, um die Migration der FACS gereinigt, ex vivo markiert transplantiert HSPCs in Mausschädelknochenmark zu überwachen. Identifizierung von einzelnen transplantierten Zellen wurde erreicht und diese über längere Zeit (hr) mit hoher Genauigkeit überwacht. Atem induzierten Bewegungsartefakten wurden minimiert und die Zellen wurden wiederholt über einen längeren Zeitverlauf reimaged.
Was sind zukünftige Richtungen?
Entwicklung der Technik könnte in Richtung Recovery-Experimente Fortschritte für die Bildgebung an mehreren Tagen zu ermöglichen, im Laufe von einer Woche oder mehr und Einsatz von Gas Anästhetika, wie Isofluran zu verkürzen und zu vereinfachen den Wiederherstellungsprozess für die Maus (Anmerkung: Recovery-Experimente erfordern streng sterile Operationsbedingungen und die Verwaltung der entsprechenden Analgetika). Entwicklerelopment einer größeren Farbpalette in vivo-Farbstoffe sowie effiziente genetische Kennzeichnung von hämatopoetischen Zellen erleichtert auch Mehrmarkierungsexperimente liefern einen besseren Einblick in die Zell-Zell-Interaktionen im Knochenmark und damit für komplexere Experimente in der Zukunft. Darüber hinaus wird die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Knochenmarkstrukturen und Stroma-Komponenten bieten ein vollständiges Bild der Ereignisse in HSPC Nischen. Bildstabilität der Zeitraffer-Filme könnten durch die Stabilisierung des Mikroskops weitere und Minimierung von Temperaturgradienten in der Probe und Akquisition führen unter Verwendung von Bildregistrierungsalgorithmen verbessert werden preacquisition.
Einschränkungen:
Das beschriebene Verfahren weist einige Einschränkungen auf. Überleben von Mäusen nach Verabreichung von Injektionsnarkose unvorhersehbar und es ist, es zu Komplikationen sehr einfach in Abhängigkeit von der individuellen Reaktion auf dieBetäubung. Im Allgemeinen ist das mehr ein Imaging-Sitzung das schwieriger für die Maus, um aus der Narkose zu erholen und es ist daher wichtig, sorgfältig zu planen, wenn die Maus zurückgewonnen werden, die Dauer der Zeitreihen-Aufnahmen bestens Begrenzung. Die Verwendung von injizierbaren Anästhetika begrenzt die Zeit jeden Imaging-Sitzung kann dauern. Während es möglich ist, die Anästhesie durch readministering eine geringere Dosis des Anästhetikums zu verlängern, ist es schwierig durchzuführen und dies genau eine Überdosierung der Maus ist eine der häufigsten Ursachen der vorzeitigen Beendigung der in vivo Bildgebung. Gasnarkose ist weniger toxisch und können für eine längere anfängliche Imaging-Sitzung, aber schnelle Erholung der Maus nach> 2 Stunden lang Verabreichung von Isofluran ist selten erfolgreich. Eine weitere Einschränkung der Technik ist die begrenzte Auflösung der Bilder, die während des Mehrpunkt-Zeitraffer Bildgebung gewonnen werden können, aufgrund der Notwendigkeit, schnell Bilder zu erwerben. Dies, gepaart mit der Brenn Drift oder Feld springt (discussed oben), kann machen Tracking von Zellen schwierig.
Vergleich mit alternativen Methoden:
HSPCs werden üblicherweise mit dem lipophilen Farbstoff markiert tat, aber DiR und DiI Farbstoffe äquivalente Alternativen und andere Zellfarbstoffe können, solange ausreichend hell verwendet werden, wie in [16] überprüft. Obwohl ex vivo-Markierung von Zellen mit gemeldet hat sich gezeigt, dass nicht auf die langfristige Funktion der HSCs, hat es die Einschränkung das hat (oder anderen chemischen Farbstoff) wird bei der Zellteilung verdünnt. Da HSCs in den ersten Tagen nach der Transplantation zu vermehren, das Signal-Rausch-Verhältnis für diese Zellen schnell verschlechtert. Endogenen Markierung von Zellen durch genetische Manipulation und Expression von fluoreszierenden Proteinen ist eine Alternative Verfahren, solange die fluoreszierenden Proteine in ausreichend hohen Mengen exprimiert, um das Signal über den Schädelknochen nachweisbar erzeugen. Es gibt eine Anzahl von alternativen techniques Verfügung Bildgebung HSPCs innerhalb der Markraum mit einer eigenen Vorteile und Einschränkungen durchzuführen, wobei jeder. Einführen des LWL-basierten Bildgebungsvorrichtungen erlaubt für die Bildgebung des Knochenmarks Rekonstitution in langen Knochen [8], während konfokale Bildgebung nach der chirurgischen Freilegung der Tibia und Verdünnung der Knochen Schmelz mit einem chirurgischen Bohrer [12] erzeugt detaillierte Bilder HSPCs Wohnsitz in Die Randbereiche der langen Knochen. Diese Verfahren sind jedoch weit mehr invasive als die hier beschriebenen und daher nicht zulassen, um Abbildungs-Sitzungen mit der gleichen Knochenmarkbereich innerhalb desselben Maus wiederholen. Darüber hinaus ist es möglich, dass diese Techniken können die beobachteten sichts der unvermeidlichen Reaktion auf erhebliche Schäden im umgebenden Gewebezellen beeinflussen. HSPCs wurden für kurze Zeit durch Deckgläser überschnitten, gebrochenen Oberschenkelknochen [11] gelegt abgebildet worden ist, ist nicht Clea jedoch die Auswirkungen dieser rauen Herstellung des Gewebes auf HSPCsr und die Technik wurde verwendet, um eindeutig einzelnen Zeitpunkt Beobachtungen zu erhalten. Feste Knochen wurden in Serienschnitte geschnitten worden und gefärbt, und die erhaltenen Bilder in ein 3D-Modell rekonstruiert und bietet hervorragende 3D-Auflösung, vor allem, wenn Gefäß Abgüsse verwendet werden [17], und vor kurzem Laser-Scanning-Zytometrie (LASC) verwendet wurde, quantitative zu erhalten Maßnahmen zu HSPCs in situ, durch Immunfärbung [18] hervorgehoben, sind aber nicht in der Lage, jede zeitliche Informationen über die Zellen Verhalten bieten. Die in dieser neuen Technik beschriebenen Techniken eine Kombination von guter Auflösung in 3D, ausreichende zeitliche Abtastung für die Überwachung der Zellen in 4D und sie sind relativ nicht-invasive, und bietet daher einen idealen Ansatz zur langfristigen Überwachung von HSPCs erreichen die Interaktion mit dem Knochenmark Mikroumgebung.
The authors have nothing to disclose.
Imaging wurde an einer aufrechten Leica SP5 konfokalen Mikroskop in der Film Anlage vom Imperial College London, von Dr. Martin Spitaler verwaltet befindet durchgeführt.
Der Probenhalter und Kopfschmuck wurde in Zusammenarbeit mit dem Chemical Engineering Department of Imperial College London, mit Tipps von Samuel Jones und Dr. Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz und CBS Mitarbeiter am Imperial College waren maßgeblich für ihre Unterstützung und Beratung auf der Maus Haltung. Mark Scott wird von HFSP und Film, Olufolake Akinduro von CRUK und Cristina Lo Celso durch CRUK, KKLF, BBSRC und HFSP finanziert.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ketamine(Narketan 100mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
Medetomidine(Domitor 1mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may b used in place of this. |
Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
PBS | multiple equivalent | n/a | |
Sterile water | multiple equivalent | n/a | |
Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1mL, 31G |
Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors – 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip) |
Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Not available | Call for quote |
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | N/A | See Figure 1 for details |
Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |