Hidrodinamik gen aktarımı ile çıplak DNA vivo transfeksiyonu minimal bir enflamatuar cevap ile hayvanın doku içine genleri getirmektedir. Gen ürününün yeterli miktarda gen fonksiyonu ve düzenleme hem de protein yapısı ve fonksiyonu analiz edilebilir şekilde oluşturulur.
In vivo olarak etkin transgenlerin ifadesi gen fonksiyonu çalışmalarında ve hastalıklar için tedavi geliştirilmesinde kritik bir önem taşımaktadır. Geçtiğimiz yıllarda, hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgenler transgenlerin sunmak için, basit, hızlı, güvenli ve etkili bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, perfüze edilmiş organ, hücre membran geçirgenliğini artırmak için fizyolojik bir solüsyon büyük hacimde hızla enjeksiyon ile oluşturulan kuvvetin dayanır ve böylece hücrelere DNA sağlar. HGD en önemli avantajlarından biri, çıplak plazmid DNA (pDNA) kullanılarak memeli hücrelerine, transgenlerin sokulması için yeteneğidir. Bir plazmid kullanılarak bir dışsal gen tanıtan son derece güvenli, minimal yüksek verimli, zahmetli ve viral taşıyıcılar aykırıdır. HGD Başlangıçta farelere gen teslim etmek için kullanılmıştır, artık oligonükleotitlerin, yapay kromozomlar, RNA, protein ve farelere küçük moleküller dahil olmak üzere, maddeler, geniş bir yelpazede, fare teslim etmek için kullanılırve sınırlı bir dereceye kadar, diğer hayvanlar. Bu protokol farelerde HGD açıklar ve başarılı bir işlemi gerçekleştirmeden için kritik olan yönteminin üç önemli yönleri üzerinde duruluyor: damara iğne doğru yerleştirilmesi, enjeksiyon hacmi ve teslimat hızı. Örnek olarak, salgılanan, primat özgü proteinleri kodlayan iki genin geçici ifadesi için, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için verilmiş olup, apolipoprotein LI (APOL-I) ve haptoglobin-ilişkili protein (HPR).
Tarafından ilk tanımlanmasından bu yana Liu ve ark. Ve Zhang ve diğ., Hidrodinamik gen teslimi (HGD) kemirgen model sistemleri 1, 2 gen fonksiyonunu incelemek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu teknik, hedef organ 1, 2 hücreleri tarafından plazmid DNA alımını kolaylaştırmak için farelerin kuyruk venine çözeltinin büyük bir miktarda (% 8-12 vücut ağırlığı) hızla enjeksiyon (5-7 saniye) içerir. Bu koşullar, böbrek, dalak, akciğer ve kalp, karaciğer ve daha az gen ifadesinde sağlam gen ekspresyonuna yol açar.
10 ug pCMV-LacZ plazmid enjeksiyonu HGD tarihinden 1 en verimli, viral olmayan, in vivo gen dağıtım yöntemi yapma, hepatositlerin 40'a kadar% transfect olabilir. Viral taşıyıcılar farklı olarak, pDNA hazırlanması kolaydır, kemirgen ana 3 bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak yoktur ve sonu ile tekrar birleştirme ile bir sağlık riski teşkil etmezogenous virüsler. HGD tarafından sağlanan DNA molekülleri paketleme gerekmez çünkü ek olarak, bu yöntem, 150 kb 4 kadar büyük bakteriyel yapay kromozom (BAC) verilmesi için uygundur. Bir hidrodinamik yöntem ile teslim edilmiştir moleküllerinin diğer tür RNA 5-10, morpholinos 11, proteinler 12, 13, ve diğer küçük moleküller 12, 14 içerir. Diğer dağıtım yöntemlerine göre HGD avantajları ve dezavantajları literatürde 15-20 mükemmel incelemelerde tartışılmış ve yazarların bir dizi prosedür 21-23 ayrıntılı bir açıklamasını sağladı.
HGD ile farelere transgenleri güvenli ve 1-3, 24 etkilidir ve yöntem, benzer başarılar 25 sıçanlarda kullanılmıştır. Bazı değişikliklerle birlikte, proof-of-concept deneyleri tavuk 26, rab olarak yürütülmüştürDaha büyük hayvanlarda, bu tekniğin in vivo uygulama için bir sorun olmaya devam etmektedir, her ne kadar, 27, domuz ve 28 bit. Bu yöntemi kullanılırken, başka bir ortak sınırlama mevcut memeli ekspresyon vektörleri çok gen ekspresyonunun bir kalıcı, yüksek düzeyde elde etmek için bileşenleri eksikliği olmasıdır. Hedef organlarda bir plasmid pCMV-Luc, gen ekspresyonunu kullanarak ancak başlangıç yüksek ifade seviyesi enjeksiyondan 1 sonraki ilk hafta içinde keskin bir şekilde düşmektedir, HGD on dakika sonra kadar erken belirgindir. Uzun vadeli bir transgen sentezleme plasmidi tasarım 3, 24. Bununla birlikte, yüksek düzeyde gen ifadesinin bakım gerektirir sık sık tekrarlanan enjeksiyonu kullanılan promoteri ve intron bağlı olarak değişiklik mümkündür. Bu nedenle, HGD zarar proteinler veya protein ürünlerine uzun süreli maruz kalmanın bir sonucu olan kronik hastalıklar incelemek için daha az uygun olabilir. Bu sınırlamalar, HGD po eğitim için son derece güçlü bir araçtırbir gen ve bunun etkisinin aşamasında potansiyel rolü (inceleme için, bakınız 15), in vivo, hem de tedavi edici etkileri ve proteinlerin düzenlenmesinde ve hastalığın hayvan modellerinde kurulması için mutantlarımn. Örneğin, tek tek HGD ilgili genlerin nakavt olan farelere çeşitli gen konstruktları getirerek etki ve proteinlerin amino asitlerine işlev atamak için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik, bir fare türünde kullanılabilir.
Teslim ven, enjeksiyon hacmi ve hız içine doğru iğne ekleme: Bu protokol, başarılı transfeksiyonunu ulaşmak için gerekli teknik yönleri odaklanarak farelerde HGD açıklanır. Bu yöntemin uygulanması Afrika trypanosomiasis, insan ölümcül bir hastalık ve çiftlik hayvanları 29, 30 sahip bir fare modelinde gösterilmiştir. Trypanosom birkaç tür hayvan hastalığa neden olsa da, çoğu b immün komplekslerin doğuştansa nedeniyle insanlarda hastalığa neden olmazlood adı tripanosom litik faktörleri (TLFs) 29, 31, 32. Bu gözenek oluşturucu, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) iki eşsiz, primat özgü protein içerir:. Trypanosom TLFs içine alınmasını kolaylaştıran HPR, ligand, ve APOL-I, litik bileşen 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense nedeniyle bağlanan ve insan APOL I-34, 39 nötralize eden bir serum direnci ile ilişkili protein (SRA) sentezlenmesi için insanları enfekte edebilmektedir. Babun TLF nedeniyle farklı APOL-I protein 40 SRA ile nötralize edilmez. Bir memeli ifade vektörü (pRG977), farelerde babun TLF bileşenlerinin transgenik ekspresyonunu kullanarak, daha önce belirtildiği gibi bir insan-enfektif trypanosom 40 karşı koruma sağlamaktadır. Burada sunulan veriler için temsili hidrodinamik gen verici bir proteinin tedavi edici etkilerini incelemek için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir.
Doğru yapıldığında, HGD transgen teslim derece güvenli ve etkili yoludur. Başarılı HGD için kritik adım vardır: 1) en az 8 saniye içinde fare 3) kuyruk damarına) tuzlu su taşıtı 2 büyük bir hacim içinde DNA doğru miktarda da sunmaktadır.
Enjeksiyon kendisinin işlem inkar edilemez bir el becerisi gerektirir, bu altı ikinci prosedürün başarısı genellikle Deneyin dikkatli bir hazırlık yatmaktadır. Maksimal gen ekspresyonunu elde etmek için gerekli pDNA miktarı,…
The authors have nothing to disclose.
Biz başlangıçta bize teknolojinin çeşitli alanlarında yaptığı sürekli rehberlik HGD tekniği ve Dr Russell Thomson (Albert Einstein Tıp Koleji) öğretim için Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) teşekkür ederim. Bu çalışma Hunter Koleji tarafından finanse edildi, CUNY fonları kurmak ve NSF Ekmek ödül IOS-1249166. Biz fare karaciğerleri üzerinde histoloji için NYULMC Histopathology Çekirdek NYUCI Merkezi Destek Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 teşekkür ederim.
Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |