In vivo transfectie van naakt DNA door hydrodynamische gen delivery introduceert genen in het weefsel van een dier met minimale ontstekingsreactie. Voldoende hoeveelheden genproduct zodanig dat gen functie en regulering en eiwitstructuur en functie kunnen worden geanalyseerd gegenereerd.
Efficiënte expressie van transgenen in vivo is van cruciaal belang bij het bestuderen van genfunctie en het ontwikkelen van behandelingen voor ziekten. In de afgelopen jaren heeft hydrodynamische genaflevering (HGD) ontpopt als een eenvoudige, snelle, veilige en effectieve methode voor het leveren van transgenen in knaagdieren. Deze techniek is gebaseerd op de kracht die door de snelle injectie van een groot volume van fysiologische oplossing om de permeabiliteit van celmembranen van geperfundeerde organen te vergroten en daarmee leveren van DNA in cellen. Een van de belangrijkste voordelen van dysplasie is de mogelijkheid om transgenen te introduceren in zoogdiercellen met naakt plasmide DNA (pDNA). Het introduceren van een exogeen gen met behulp van een plasmide is minimaal moeizaam, zeer efficiënte en, in tegenstelling tot virale dragers, opmerkelijk veilig. HGD werd aanvankelijk gebruikt om genen in muizen, wordt nu gebruikt om een breed scala van stoffen, waaronder oligonucleotiden, kunstmatige chromosomen, RNA, eiwitten en kleine moleculen in muizen, ratten leverenen, in beperkte mate, andere dieren. Dit protocol beschrijft HGD in muizen en richt zich op drie belangrijke aspecten van de methode die kritisch zijn voor het uitvoeren van de procedure met succes zijn: correct inbrengen van de naald in de ader, het volume van de injectie en de snelheid van levering. Voorbeelden worden gegeven aan de toepassing van deze werkwijze tonen voor de transiënte expressie van twee genen die uitgescheiden, primaat-eiwitten coderen, apolipoproteine LI (APOL-I) en haptoglobine-verwant eiwit (HPR).
Sinds de eerste beschrijving van Liu et al.. En Zhang et al.., Hydrodynamische genaflevering (HGD) is uitgegroeid tot een waardevol instrument voor het bestuderen van gen-functie in knaagdier modelsystemen 1, 2. De techniek omvat de snelle injectie (5-7 seconden) van een groot volume (8-12% lichaamsgewicht) oplossing in de staartader van muizen om de opname van plasmide DNA door de cellen van doelorganen 1, 2 vergemakkelijken. Deze omstandigheden leiden tot sterke genexpressie in de lever en minder genexpressie in de nieren, milt, long en hart.
Injectie van 10 ug pCMV-lacZ plasmide transfecteren maar liefst 40% van hepatocyten, waardoor dysplasie de meest efficiënte, niet-virale, in vivo gentherapie methode tot heden 1. In tegenstelling tot de virale dragers, pDNA is gemakkelijk te bereiden, niet een immuunrespons in het knaagdier gastheer 3 uitlokken en geen risico voor de gezondheid kunnen opleveren doordat recombineren met eindogenous virussen. Bovendien, omdat de DNA-moleculen door dysplasie geleverde niet verpakking nodig is deze werkwijze geschikt voor de levering van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) zo groot als 150 kb 4. Andere soorten moleculen die door een hydrodynamisch werkwijze zijn geleverd omvatten RNA 5-10, morpholinos 11, eiwitten 12, 13 en andere kleine moleculen 12, 14. De voor-en nadelen van HGD opzichte van andere aflevering methoden zijn in uitstekende recensies besproken in de literatuur 15-20 en een aantal auteurs hebben een gedetailleerde beschrijving van de procedure 21-23.
Introductie van transgenen in muizen door HGD is veilig en effectief 1-3, 24 en de methode is gebruikt bij ratten met een vergelijkbaar succes 25. Bij bepaalde wijzigingen, proof-of-concept-experimenten zijn uitgevoerd bij kippen 26, rab uitgevoerdDe bits 27 en 28 varkens, hoewel de in vivo toepassing van deze techniek in grotere dieren blijft een uitdaging. Deze meetmethode, een gemeenschappelijke beperking is dat veel van de beschikbare zoogdierlijke expressievectoren niet de componenten tot een blijvende, hoge genexpressie. Met een pCMV-Luc plasmide genexpressie in de doelorganen is merkbaar vanaf tien minuten na HGD echter de aanvankelijk, hoog expressieniveau daalt scherp in de eerste week na injectie 1. Langdurige transgenexpressie is mogelijk, afhankelijk van de promotor en intron gebruikt in plasmide design 3, 24 echter, het onderhoud van high-level genexpressie vereist vaak herhaalde injecties. Daarom kan dysplasie minder geschikt chronische ziekten die het gevolg zijn van langdurige blootstelling aan schadelijke eiwitten of producten bestuderen. Met deze beperkingen, HGD is een uitzonderlijk krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de potentieel rol van een gen en het effect ervan mutanten in vivo, evenals de therapeutische effecten en regulatie van eiwitten en de vaststelling van diermodellen van de ziekte (zie voor 15). Bijvoorbeeld kan dysplasie worden gebruikt om functie aan domeinen en aminozuren van eiwitten door afzonderlijk introduceren verschillende genconstructen in muizen die de respectieve genen uitgeschakeld. Verder kan deze techniek worden gebruikt in elke muizenstam.
Dit protocol beschrijft HGD in muizen met een focus op de technische aspecten die nodig zijn om een succesvolle transfectie bereiken: de juiste naald inbrengen in de ader, injectie volume en de snelheid van levering. De toepassing van deze methode wordt gedemonstreerd in een muismodel van Afrikaanse trypanosomiasis, een fatale ziekte bij mensen en dieren 29, 30. Terwijl verschillende soorten trypanosomen veroorzaken ziekte bij vee, kunnen de meeste niet ziekte veroorzaken bij de mens als gevolg van immuuncomplexen aangeboren blood genoemd trypanosome lytische factoren (TLFs) 29, 31, 32. Deze porievormende, high-density lipoproteïnen (HDL) bevat twee unieke, primaat-eiwitten. HPR, het ligand, die de opname van TLFs in trypanosomen vergemakkelijkt en APOL-I, de lytische component 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense is in staat om mensen te besmetten als gevolg van de expressie van een serum-resistentie geassocieerde eiwit (SRA) dat bindt aan en neutraliseert de menselijke APOL-I 34, 39. Baviaan TLF wordt niet geneutraliseerd door SRA vanwege de uiteenlopende APOL-I-eiwit 40. Zoals eerder gemeld, met een zoogdierexpressievector (pRG977), transgene expressie van baviaan TLF componenten in muizen bescherming biedt tegen humane infecties trypanosomen 40. De representatieve hier gepresenteerde gegevens demonstreren hoe hydrodynamische gentherapie worden toegepast om de therapeutische werking van een eiwit te bestuderen.
Wanneer correct uitgevoerd, HGD is een opmerkelijk veilige en effectieve manier van transgene levering. De kritische stappen succesvolle dysplasie zijn: 1) het leveren van de juiste hoeveelheid DNA in een groot volume zoutoplossing voertuig 2) in de staartader van de muis 3) in minder dan 8 seconden.
Hoewel het proces van de injectie zelf onmiskenbaar vereist enige handigheid, het succes van deze zes-tweede procedure ligt vaak in een zorgvuldige voorbereiding van het experiment. De hoeveelhe…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) voor initieel onderwijs ons de HGD techniek en Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) zijn continue begeleiding in de verschillende aspecten van de technologie. Dit werk werd gefinancierd door Hunter College, CUNY opstarten fondsen en NSF Brood award IOS-1249166. Wij danken de NYULMC Histopathology Core NYUCI Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 voor histologie op de muis levers.
Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |