Transiente Expression von Proteinen durch Hydrodynamische Gentransfer in Mäusen
Summary
In-vivo-Transfektion von nackter DNA durch hydrodynamische Genübertragung führt Gene in das Gewebe eines Tieres mit minimalen Entzündungsreaktion. Ausreichende Mengen an Genprodukt erzeugt werden, so dass Genfunktionen und Regelung sowie die Proteinstruktur und Funktion untersucht werden.
Abstract
Effiziente Expression von Transgenen in vivo ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung der Genfunktion und der Entwicklung von Behandlungen für Krankheiten. In den letzten Jahren hat hydrodynamische Gentransfer (HGD) als eine einfache, schnelle, sichere und effektive Methode für die Bereitstellung von Transgenen in Nagetiere entstanden. Diese Technik beruht auf der von der schnellen Injektion einer großen Menge einer physiologischen Lösung, um die Durchlässigkeit der Zellmembranen des perfundierten Organen erhöhen erzeugte Kraft und liefern somit DNA in Zellen. Einer der Hauptvorteile der HGD ist die Fähigkeit, Transgene in Säugerzellen unter Verwendung nackter Plasmid-DNA (pDNA) einzuführen. Einführen eines exogenen Gens unter Verwendung eines Plasmids ist minimal aufwendig, sehr leistungsfähig und im Gegensatz zu viralen Träger, bemerkenswert sicher. HGD wurde ursprünglich verwendet, um Gene in Mäuse zu liefern, wird nun verwendet, um eine Vielzahl von Stoffen, einschließlich Oligonukleotide, künstliche Chromosomen, RNA, Proteine und kleine Moleküle in Mäuse, Ratten liefernund bis zu einem begrenzten Grad, andere Tiere. Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen und konzentriert sich auf drei zentrale Aspekte der Methode, die entscheidend für den erfolgreichen Durchführung des Verfahrens sind: richtige Einführen der Nadel in die Vene, das Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Lieferung. Beispiele werden gegeben, um die Anwendung dieser Methode auf die transiente Expression von zwei Genen, die abgesondert wird, Primaten-spezifische Proteine kodieren zeigen, Apolipoprotein LI (APOL-I) und Haptoglobin-related protein (HPR).
Introduction
Seit der ersten Beschreibung von Liu et al. Und Zhang et al., Hydrodynamische Gentransfer (HGD) hat sich ein unschätzbares Werkzeug für die Untersuchung der Genfunktion in Nagetier-Modellsysteme 1, 2. Die Technik beinhaltet die schnelle Injektion (5-7 sec) von einem großen Volumen (8-12% des Körpergewichts) der Lösung in die Schwanzvene von Mäusen, die Aufnahme von Plasmid-DNA durch die Zellen des Zielorganen 1, 2 zu erleichtern. Diese Bedingungen führen zu robusten Genexpression in der Leber und weniger Gen-Expression in der Niere, Milz, Lunge und Herz.
Injektion von 10 ug pCMV-LacZ-Plasmid kann so viel wie 40% der Leberzellen zu transfizieren, so dass HGD die effizienteste, nicht-viralen, in vivo Genübertragung Verfahren Beginn 1. Anders als Virusträger, ist pDNA einfach zuzubereiten, ist eine Immunantwort in der Nagetier-Host 3 nicht zu entlocken ist und nicht ein Gesundheitsrisiko darstellen durch Rekombination mit Endeexogenen Viren. Zusätzlich kann, da die DNA-Moleküle durch HGD geliefert brauchen nicht Verpackung, eignet sich dieses Verfahren für die Bereitstellung von künstlichen Bakterienchromosomen (BAC) so groß wie 150 4 kb. Andere Arten von Molekülen, die durch ein hydrodynamisches Verfahren geliefert worden sind, umfassen RNA 5-10, 11 Morpholinos, Proteine 12, 13 und andere kleine Moleküle 12, 14. Die Vor-und Nachteile der HGD gegenüber anderen Versandmethoden sind in sehr guten Bewertungen in der Literatur 15-20 diskutiert und eine Reihe von Autoren haben eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise 21 bis 23 vorgesehen.
Einführen von Transgenen in Mäusen durch HGD ist sicher und wirksam 1-3, 24 und das Verfahren wurde bei Ratten mit vergleichbarem Erfolg 25 verwendet. Mit gewissen Modifikationen, Proof-of-Concept-Experimente wurden in 26 Hühner, Kaninchen durchgeführtBits 27 und 28 Schweine, obwohl die in vivo Anwendung dieser Technik bei größeren Tieren bleibt eine Herausforderung. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist eine weitere gemeinsame Einschränkung, dass viele der verfügbaren Säugetierexpressionsvektoren nicht über die Komponenten, um eine anhaltende, hohe Genexpression zu erreichen. Mit einem pCMV-Luc-Plasmid, die Genexpression in den Zielorganen ist offensichtlich so früh wie zehn Minuten nach HGD fällt jedoch die anfängliche, hohe Expressionsniveau stark in der ersten Woche nach der Injektion ein. Langzeit-Expression des Transgens ist möglich, je nach dem Promotor und Intron in Plasmid-Design 3, 24 jedoch, Wartung von High-Level-Genexpression erfordert häufig wiederholte Injektionen verwendet. Aus diesem Grund könnte HGD weniger geeignet, um chronische Krankheiten, die eine Folge der langfristigen Exposition gegenüber schädlichen Proteine oder Proteinprodukte sind zu studieren. Mit diesen Einschränkungen ist HGD ein außergewöhnlich leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der pozial Rolle des Gens und die Wirkung davon Mutanten in vivo, als auch die therapeutischen Wirkungen und Regulation von Proteinen und für die Festlegung von Tiermodellen der Erkrankung (für eine Übersicht siehe 15). Zum Beispiel kann verwendet werden, um Funktion HGD, Domains und Aminosäuren von Proteinen durch Einbringen individuell verschiedene Genkonstrukte in Mäusen, wurden die entsprechenden Gene ausgeknockt zuzuweisen. Darüber hinaus kann diese Technik in jedem Mausstamm verwendet werden.
Dieses Protokoll beschreibt HGD bei Mäusen mit einem Fokus auf die technischen Aspekte notwendig, um eine erfolgreiche Transfektion zu erreichen: Die richtige Nadeleinführung in die Vene, Einspritzmenge und die Geschwindigkeit der Lieferung. Die Anwendung dieses Verfahrens ist in einem Mausmodell der afrikanischen Trypanosomiasis, einer tödlichen Erkrankung von Mensch und Vieh 29, 30 gezeigt. Während einige Arten der Trypanosomen verursachen Krankheit in Nutztiere, können die meisten nicht-Krankheit beim Menschen durch Immunkomplexe in b angeborenen verursachenlood genannt Trypanosomen lytische Faktoren (Tlfs) 29, 31, 32. Diese porenbildenden, hochdichten Lipoproteinen (HDL) enthält zwei einzigartige, Primaten-spezifischen Proteinen:. HPR, die Liganden, die die Aufnahme von Tlfs in Trypanosomen erleichtert und APOL-I, die lytische Komponente 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense der Lage ist, Menschen aufgrund der Expression eines mit Serumresistenz assoziierten Proteins (SRA), das bindet und neutralisiert menschliche APOL-I 34, 39 zu infizieren. Baboon TLF wird nicht von SRA aufgrund ihrer divergierenden APOL-I-Protein 40 neutralisiert. Wie bereits berichtet, mit einem Säugetier-Expressionsvektor (pRG977), transgenen Expression von Pavian TLF-Komponenten in Mäusen einen Schutz gegen die Menscheninfektiösen Trypanosomen 40. Die hier präsentierten Daten demonstrieren, wie repräsentativ hydrodynamischen Genübertragung angewendet werden, um die therapeutischen Wirkungen des Proteins zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wenn richtig ausgeführt, ist HGD ein bemerkenswert sicheres und wirksames Mittel der Trans Lieferung. Die kritischen Schritte zur erfolgreichen HGD sind: 1) Bereitstellung der richtigen Menge von DNA in einem großen Volumen an Kochsalzträger 2) in die Schwanzvene der Maus, 3) in weniger als 8 Sekunden.
Obwohl der Prozess der Injektion selbst erfordert zweifellos etwas Fingerfertigkeit, der Erfolg dieser sechs zweite Verfahren liegt oft in der sorgfältigen Vorbereitung des Experiments. Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Xia Liu (Neron Pharmaceuticals) für zunächst lehrt uns die HGD Technik und Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) für seine kontinuierliche Führung in verschiedenen Aspekten der Technologie. Diese Arbeit wurde vom Hunter College finanziert CUNY Startkapital und NSF Brot Auszeichnung IOS-1249166. Wir danken der NYULMC Histopathologie Kern NYUCI Center Support Grant, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 für die Histologie auf Mäuselebern.
Materials
| Alcohol Prep Wipe | Webcol | 6818 | |
| AST kit, Amplite Colorimetric | AAT Bioquest | 13801 | |
| Conical Tube, 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| KimWipes | KIMTECH | 34120 | |
| Mouse Tail Illuminator | Braintree Scientific | MTI RST | Or equivalent |
| Needle, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm) | BD | 305175 | |
| Needle, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm) | BD | 305109 | |
| pRG977 (mammalian expression vector) | Regeneron Pharmaceuticals | Material Transfer Agreement required | |
| Sodium Chloride, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| Syringe, 3ml, Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Luer Lock necessary to withstand pressure from HGD |
References
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