Descriviamo una tecnica per l'analisi della sintesi dell'RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell'RNA globale.
Ipossia o abbassamento della disponibilità di ossigeno è coinvolto in molti processi fisiologici e patologici. A livello molecolare, le cellule iniziano un particolare programma trascrizionale per montare una risposta cellulare appropriato e coordinato. La cella possiede parecchi enzimi sensore di ossigeno che richiedono ossigeno molecolare come cofattore per la loro attività. Queste vanno da prolina-idrossilasi a demethylases istoni. La maggior parte degli studi che analizzano risposte cellulari all'ipossia sono basati su popolazioni cellulari e studi medi, e come tale analisi singola cella di cellule ipossiche sono raramente eseguita. Qui si descrive un metodo di analisi della sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia utilizzando i kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllata, seguita da analisi al microscopio e quantificazione. Utilizzando cellule tumorali esposte all'ipossia per periodi di tempo diversi, RNA è etichettato e misurato in ogni cella. Questa analisi consentela visualizzazione e cellula-cellula cambiamenti temporali sintesi dell'RNA globale seguenti stress ipossico.
Ipossia (tensioni basse ossigeno) si verifica quando il normale di ossigeno ad un tessuto è disturbato. Ossigeno ambientale è sia una sostanza nutritiva e una molecola di segnalazione, fornendo spunti importanti per vari tipi di cellule. Le variazioni di ossigeno ambientale vengono rilevati da un gruppo di diossigenasi che controllano l'attività di un fattore di trascrizione essenziale famiglia conosciuta come i fattori inducibili ipossia (HIF). Le HIF sono composte da due subunità, α e β. Ci sono tre isoforme conosciute di HIF-α (1, 2, e 3) e molteplici varianti di splicing di HIF-1β. HIF-1β è costitutivamente espresso e non regolato da livelli di ossigeno ambientali 1. I membri della famiglia HIF-α sono regolate in modo dinamico da una classe di prolina-idrossilasi (dottorati di ricerca) e il fattore di inibizione HIF (FIH); che richiedono entrambi ossigeno come co-fattore per catalizzare l'idrossilazione di HIF-α 2,3. In normoxia i familiari HIF-α sono idrossilati e contrassegnati per proteosomal degrado della E3-ligasi, von Hippel Lindau (VHL). In ipossia i dottorati e FIH sono inattivi o hanno una ridotta attività. Le isoforme HIF-α stabilizzarsi, formano un eterodimero con HIF-1β, e per effetto di trascrizione di geni che forniscono la risposta cellulare all'ambiente ipossico (Figura 1A) 4.
Attuali tecniche di analisi dell'RNA concentrano sulla quantificazione dei valori medi di tutti una data popolazione cellulare. Le cellule rispondono a uno stimolo ipossico avviando la trascrizione di una miriade di geni che permettono loro di adattarsi al loro ambiente ostile 5. Tuttavia, ipossia esiste spesso una sfumatura e cellule in un ambiente ipossico non sono soggetti ad uno stimolo ipossico uniforme. Descriviamo una implementazione dei kit di imaging RNA Click-iT in una workstation di ossigeno controllato per esaminare la sintesi di RNA globale a livello di singola cellula in ipossia.
Il kit imaging RNA utilizza un anucleoside lkyne modificati, 5-etinile uridina (UE) e legatura chemoselective abilitare il rilevamento di sintesi di RNA globale temporalmente e spazialmente in cellule e tessuti 6. Brevemente, le cellule vengono trattate con ipossia e coltivate in presenza di UE. Vengono poi fissate e permeabilizzate e l'incorporazione UE in RNA nascente viene rilevato mediante legatura chemoselective dell'UE con azide contenente colorante. Un flusso di lavoro tipico per questa reazione è mostrato in Figura 1B. Abbiamo utilizzato il kit imaging RNA esaminare sintesi di RNA a livello di singola cellula che ha portato dal trattamento con ipossia.
Le ridotte dimensioni del tag alchino consente incorporazione efficiente del nucleoside modificato in RNA specifico. La legatura chemoselective o 'click' di reazione è altamente efficiente, veloce e specifico 7-10. Tutti i componenti di reazione sono bioinerte e la reazione non richiede temperature estreme o solventi. La reazione click negail requisito per la radiomarcatura convenzionale e permette la visualizzazione diretta dei risultati poiché l'uscita è leggero. Inoltre, la molecola di rilevamento può facilmente penetrare campioni complessi per consentire analisi multiplex compresi gli anticorpi per la rilevazione di proteine RNA-interattiva. Questo test di imaging RNA è compatibile con coloranti organici, tra cui Alexa Fluor e fluoresceina (FITC).
Abbiamo misurato il cambiamento di sintesi di RNA dopo il trattamento delle nostre cellule utilizzando un'implementazione dell'ambiente microscopia porta oggetti remoti (OMERO). OMERO è un software open-source, disponibile all'indirizzo http://openmicroscopy.org/ . Questo software microscopio di visualizzazione e analisi delle immagini consente l'accesso a, e l'utilizzo di una vasta gamma di dati biologici, compresa la gestione di set di dati multidimensionali, eterogenei. L'applicazione client consente la visualizzazione e l'analisi di complessi dati immagine biologica 11 remoto;abbiamo usato per quantificare i cambiamenti visivi a livello mondiale e un'unica sintesi di RNA cellulare. Questi dati e le operazioni necessarie per analizzare il nostro esperimento di imaging RNA utilizzando questo microscopio visualizzazione di immagini e software di analisi sono riportati di seguito.
Abbiamo esaminato i cambiamenti nella sintesi di RNA globale a seguito del trattamento di osteosarcoma umano (U2OS), le cellule con ipossia fino a 24 ore. In tutte le condizioni, abbiamo rilevato cellula-cellula variazione del livello di produzione di RNA. Tempi brevi di esposizione all'ipossia non hanno comportato cambiamenti significativi al livello di RNA nascente nelle cellule. Tuttavia, l'esposizione di 24 ore di ipossia determinato un aumento significativo della quantità di RNA prodotta in cellule. La maggior parte delle risposte cellulari all'ipossia sono misurate seguenti periodi prolungati di esposizione, come quelli 4 a 24 ore. Tuttavia, alcuni meccanismi vengono messi in atto molto prima, per esempio; Attivazione di NF-kB si verifica entro 5-15 min dell'ipossia esposizione 12. Indagare ipo brevetempi di esposizione Xia è quindi giustificato e potrebbe sminuire le risposte più complesse, come il ciclo cellulare e l'apoptosi.
Abbiamo descritto il nostro utilizzo di un kit imaging RNA per esaminare gli effetti dell'ipossia sulla sintesi di RNA in osteosarcoma (U2OS) cellule. Questa tecnica è relativamente semplice e fornisce dati relativi trascrizione globale a livello di singola cellula. Abbiamo modificato il protocollo convenzionale per questo kit per incorporare etichettatura in una camera di ipossia. A nostra conoscenza questo è il primo rapporto di utilizzo di questa tecnica per misurare le variazioni di sintesi dell'RNA in ipossia. Il kit imaging RNA abbiamo usato è adatto per la sperimentazione in ipossia poiché richiede isotopi radioattivi e tecnicamente compatibili con le limitazioni di lavorare in una workstation atmosfera controllata. I problemi più comuni con questo fissazione efficiente tecnica preoccupazione e l'etichettatura del campione. E 'estremamente importante che il PFA utilizzata per fissare il campione è fresco e le fasi di lavaggio che seguono la reazione' scegliere 'vengono eseguite come descritto per garantire bassa bassa colorazione del campione. Se background fluorescenza diventa un problema, si raccomanda di lavare ancora una volta con 1 ml di imaging RNA tampone di reazione kit di risciacquo dopo il punto 2.7.4.
Il kit imaging RNA qui menzionato rappresenta un avanzamento significativo nella tecnologia di imaging RNA in termini di semplicità d'uso e la specificità e la velocità di reazione. Questa tecnica è limitata principalmente dal tempo necessario per etichettare il campione. Il kit imaging RNA richiede un periodo di etichettatura 1 ora che impedisce l'esame dei rapidi cambiamenti RNA globale che si verificano di solito entro questo lasso di tempo. E 'per questo motivo il nostro punto prima volta è limitato a 1 ora e 15 min. La tecnica è associata con poche altre limitazioni che riguardano principalmente reagente compatibilità con altri marcatori fluorescenti, per esempio, questo kit imaging RNA non è compatibile con falloidina colorazione.
Tutti gli approcci esistenti di studiare la sintesi di RNA in cellule sono basati su incorporazione di nucleosidi modificati nellaRNA nascente e il rilevamento di etichette incorporate con mezzi diversi. L'approccio pionieristico si è basata sull'utilizzo di precursori di RNA marcati radioattivamente seguita da rilevamento con autoradiografia. Questo metodo ha portato alla scoperta di fasi del ciclo cellulare e altri reperti importanti; tuttavia, ha un sacco di svantaggi, come la macchinosità del lavoro radioattività, tempi di esposizione lunghi e le immagini a bassa risoluzione di autoradiografia 6. Il successivo avanzamento nel campo sfruttato mezzi dell'immunochimica per eliminare la necessità di radioattività. RNA è stato etichettato per incorporazione di Bru seguita da rilevazione immunochimica. Tuttavia, anticorpo efficace legame necessario denaturazione degli acidi nucleici per migliorare l'accesso al DNA o RNA che ha causato la perdita di morfologia cellulare e danneggiato gli epitopi di molte proteine, impedendo loro ulteriore rilevazione con anticorpi fluorescente 13. L'introduzione della tecnologia 'click chemistry' semplificato il processo di rilevamento e tegli procedura rispetto a autoradiografia e immunochimica. La tecnologia è basata su azide-alchino Huisgen reazione di cicloaddizione dove alchino terminale 5-ethyniluridine lega con azide coniugato con il fluoroforo in presenza di Cu (I). La reazione è specifica, rapida, non richiede ulteriori passaggi, ed è facilmente compatibile con la rilevazione immunochimica di altri costituenti cellulari.
Utilizzando questa tecnologia di imaging RNA abbiamo dimostrato che le cellule, nella stessa popolazione monostrato, hanno diversi livelli di sintesi di RNA in risposta all'ipossia. Abbiamo ristretto il nostro esperimento per esaminare l'effetto della sola produzione di RNA; tuttavia, è del tutto possibile con questo kit imaging RNA modificati, effettuare ulteriori reazioni multiplex che consentono una più complessa analisi della produzione di RNA. Ad esempio, la colorazione secondaria utilizzando un anticorpo specifico per marcatori di trascrizione attivi quali i livelli di fosforilazione RNA polimerasi II o anche componenti della traduzionezione macchinari per dare un'indicazione della quantità di questo RNA di nuova produzione che viene convertito in proteine sono possibili. Proteine addizionali, quali actina, una proteina che non dovrebbe cambiare significativamente con ipossia, possono essere testati come controllo aggiuntivo. Inoltre, diversi tipi cellulari possono essere testate, in quanto è molto probabile che le cellule differenti avranno differenti tassi di sintesi di RNA e anche risposte diverse a ipossia.
L'utilizzo di questo kit imaging RNA è molto semplice, purché i passaggi vengono eseguiti come descritto. Passaggi critici nel protocollo riguardano placcatura cellule, la fissazione delle cellule e la colorazione e l'acquisizione delle immagini. E 'importante per placcare le cellule ad una densità descritto per evitare sopra o sotto confluenza in sperimentazione che influenzerà notevolmente il risultato. E 'anche importante usare fissativo fresco, assicurando la migliore' fotografia 'della cellula è preso e curare quando si lava le cellule dopo colorazione per ridurre il background ad un livello accettabile per l'analisi efficiente. Infine, il metodo di acquisizione di immagini è di vitale importanza per ottenere immagini che sono di buona qualità sufficiente per la successiva analisi. Si consiglia di utilizzare il miglior microscopio ottico a disposizione per esaminare i campioni otticamente come il microscopio utilizzato in questo protocollo che è disponibile presso i centri più intensivo di ricerca a livello globale.
The authors have nothing to disclose.
JB è un collega clinico CRUK, AS è uno studente di dottorato Wellcome Trust, il laboratorio di SR è finanziato da un CRUK Senior Research Fellowship (C99667/A12918). Questo lavoro è stato supportato da due Wellcome Trust Awards strategici (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |