نحن تصف تقنية لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية في نقص الأكسجة باستخدام التصوير. لم يسبق إجراء انقر الكيمياء وضع العلامات من الحمض النووي الريبي في ظل نقص الأكسجين ويسمح التصور من التغييرات RNA العالمية على مستوى خلية واحدة. هذا النهج يكمل تقنيات الحمض النووي الريبي متوسط الموجودة، مما يتيح رؤية مباشرة من خلية الى خلية تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية.
وتشارك نقص الأكسجة أو خفض توافر الأكسجين في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. على المستوى الجزيئي، خلايا بدء برنامج النسخي خاصة من أجل جبل استجابة الخلوية مناسبة ومنسقة. الخلية تمتلك العديد من الانزيمات مستشعر الاوكسجين التي تتطلب الأكسجين الجزيئي كما العامل المساعد لنشاطها. هذه مجموعة من prolyl-hydroxylases لdemethylases هيستون. وتستند غالبية الدراسات تحليل الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة الخلوية على السكان ومتوسط الدراسات، وعلى هذا النحو تحليل خلية واحدة من خلايا ميتة ونادرا ما يؤديها. نحن هنا تصف طريقة لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة باستخدام نقرة-IT مجموعات التصوير الحمض النووي الريبي في محطة الأكسجين للرقابة، يليه التحليل المجهري والكمي. باستخدام الخلايا السرطانية تتعرض لنقص الأكسجين لفترات مختلفة من الزمن، هو المسمى الحمض النووي الريبي ويقاس في كل خلية. يسمح هذا التحليلتصور والخلية الى خلية التغيرات الزمنية في توليف الحمض النووي الريبي العالمية عقب التوتر ميتة.
نقص الأكسجة (الأكسجين المنخفضة التوتر) ويحدث عندما يضطرب تزويد الأكسجين العادي إلى الأنسجة. الأكسجين البيئية على حد سواء والمغذيات وجزيء إشارة، وتوفير الاشارات الهامة لكثير من أنواع الخلايا. ومست التغييرات في الأكسجين البيئية من قبل مجموعة من dioxygenases التي تتحكم في نشاط عائلة عامل النسخ الأساسية المعروفة باسم عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs). وتتألف من اثنين من مفارز HIFs، α β و. هناك ثلاثة الإسوية معروفة من مؤسسة الحرمين، α (1، 2، و 3) والمتغيرات لصق متعددة من مؤسسة الحرمين، 1β. يتم التعبير عن مؤسسة الحرمين، 1β جوهري والتي لا تنظمها مستويات الاوكسجين البيئية 1. ويتم تنظيم أفراد الأسرة مؤسسة الحرمين، α بشكل حيوي بواسطة فئة من prolyl-hydroxylases (الدكتوراه) وعامل تثبيط مؤسسة الحرمين (FIH)؛ وكلاهما يتطلب الأكسجين باعتبارها عامل مساعد لتحفيز الهيدروكسيل من مؤسسة الحرمين، α 2،3. في normoxia والهيدروكسيلية أعضاء الأسرة مؤسسة الحرمين α والمعلمة لproteosomتدهور آل من E3-يغاز، فون هيبل لينداو (VHL). في نقص الأكسجة والدكتوراه وFIH غير نشطة أو لديهم انخفاض النشاط. تصبح الأشكال الإسوية-α استقرت مؤسسة الحرمين، تشكيل مغاير مع مؤسسة الحرمين، 1β، وتؤثر على نسخ من الجينات التي توفر استجابة الخلايا للبيئة ميتة (الشكل 1A) 4.
التقنيات الحالية لتحليل الحمض النووي الريبي التركيز على القياس الكمي للقيم المتوسط عبر السكان خلية معينة. خلايا الاستجابة لحافز نقص الأوكسجين قبل بدء النسخ من عدد لا يحصى من الجينات التي تسمح لهم للتكيف مع بيئة معادية لهم 5. ومع ذلك، في كثير من الأحيان نقص الأكسجين كما هو معمول به التدرج، وخلايا في بيئة ميتة لا تخضع لحافز نقص الأوكسجين موحدة. نحن تصف تنفيذ مجموعات التصوير RNA نقرة-IT في محطة الأكسجين للرقابة لفحص الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة.
يستخدم عدة التصوير الحمض النووي الريبي للنوكليوزيد lkyne تعديل، 5-إيثينيل يوريدين (الاتحاد الأوروبي) وربط chemoselective لتمكين الكشف عن الحمض النووي الريبي التوليف العالمي زمنيا ومكانيا في الخلايا والأنسجة 6. لفترة وجيزة، ويتم التعامل مع الخلايا نقص الأكسجة والمثقف في وجود الاتحاد الأوروبي. ثم تم إصلاحها وأنها permeabilized ويتم الكشف عن إدماج الاتحاد الأوروبي في الحمض النووي الريبي الوليدة عن طريق ربط chemoselective من الاتحاد الأوروبي مع أزيد التي تحتوي على الصبغة. ويرد سير العمل النموذجية لهذا التفاعل في الشكل 1B. استخدمنا عدة التصوير الحمض النووي الريبي لفحص الحمض النووي الريبي التوليف على مستوى خلية واحدة التي نتجت عن المعاملة مع نقص الأكسجة.
صغر حجم العلامة آلكاين يتيح إدماج الفعال للنوكليوزيد تعديل في الحمض النووي الريبي على وجه التحديد. وربط chemoselective أو رد فعل 'فوق' هو ذات كفاءة عالية وسريعة ومحددة 7-10. كافة المكونات هي رد فعل bioinert ويتطلب رد فعل لا درجات الحرارة القصوى أو المذيبات. ينفي رد فعل نقرةشرط radiolabelling التقليدية ويسمح التصور المباشر للنتائج منذ الإخراج هو الضوء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للجزيء كشف اختراق بسهولة عينات معقدة مما يسمح للتحليل المتعدد بما في ذلك الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات الحمض النووي الريبي التفاعلية. هذا الاختبار الحمض النووي الريبي التصوير متوافق مع الأصباغ العضوية بما في ذلك اليكسا فلور وفلوريسئين (FITC).
قمنا بقياس التغير في تخليق الحمض النووي الريبي بعد العلاج من خلايانا باستخدام تنفيذ بيئة مفتوحة المجهري للكائنات عن بعد (أوميرو). أوميرو هو برنامج مفتوح المصدر، متاح على http://openmicroscopy.org/ . هذا المجهر التصور الصورة وتحليل البرمجيات تمكن من الوصول إلى واستخدام مجموعة واسعة من البيانات البيولوجية، بما في ذلك إدارة متعددة الأبعاد، قواعد البيانات غير المتجانسة. تطبيق العميل يسمح التصور عن بعد وتحليل البيانات البيولوجية المعقدة الصورة 11؛نحن استخدامه لقياس التغيرات البصرية في توليف الحمض النووي الريبي الخلية العالمية واحدة. وتظهر هذه البيانات والخطوات المطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي لدينا تجربة التصوير باستخدام هذا المجهر التصور الصورة وبرامج التحليل أدناه.
ونحن ننظر في تغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية التالية علاج عظمية الإنسان (U2OS) الخلايا مع نقص الأكسجين لمدة تصل إلى 24 ساعة. في جميع الظروف، ونحن الكشف عن الاختلاف الخلية الى خلية في مستوى إنتاج الحمض النووي الريبي. لم أوقات قصيرة من التعرض نقص الأكسجة لا تؤدي إلى تغييرات كبيرة على مستوى الحمض النووي الريبي في الخلايا الوليدة. ومع ذلك، أدى التعرض إلى 24 ساعة من نقص الأكسجة إلى زيادة كبيرة في كمية من الحمض النووي الريبي التي تنتج في الخلايا. يتم قياس معظم الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة التالي فترات طويلة من التعرض، مثل 4-24 ساعة. ومع ذلك، يتم وضع بعض الآليات في مكانها في وقت سابق من ذلك بكثير، على سبيل المثال؛ يحدث تفعيل NF كيلوبايت في غضون 5-15 دقيقة من التعرض نقص الأكسجة 12. التحقيق أقصر فراش لا تسببوبالتالي هناك ما يبرر مرات التعرض شيا ويمكن أن ينتقص من استجابات أكثر تعقيدا مثل دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج.
وصفناها استخدامنا لعدة التصوير الحمض النووي الريبي لدراسة آثار نقص الأكسجين على توليف الحمض النووي الريبي في عظمية (U2OS) الخلايا. هذا الأسلوب هو بسيط نسبيا ويوفر بيانات حول النسخ العالمية على مستوى خلية واحدة. نحن تعديل البروتوكول التقليدي لهذه المجموعة لدمج الوسم في غرفة نقص الأكسجة. على حد علمنا هذا هو أول تقرير عن استخدام هذه التقنية لقياس التغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي في نقص الأكسجة. عدة التصوير الحمض النووي الريبي التي استخدمناها هي مناسبة للتجريب في نقص الأكسجين لأنه لا يتطلب أي نظائر مشعة ومتوافق من الناحية الفنية مع القيود المفروضة على العمل في محطة عمل الغلاف الجوي للرقابة. المشاكل المشتركة مع هذا التثبيت كفاءة تقنية القلق ووضع العلامات من العينة. فمن المهم للغاية أن PFA تستخدم لإصلاح العينة هو جديد ويتم تنفيذ الخطوات غسل أن متابعة رد فعل 'فوق' كما هو موضح لضمان انخفاض تلوين الخلفية من العينة. إذا بackground يصبح مضان مشكلة فمن المستحسن أن يغسل مرة أخرى مع 1 مل التصوير RNA العازلة شطف رد فعل عدة بعد الخطوة 2.7.4.
عدة التصوير RNA المذكورة هنا يمثل تقدما كبيرا في تكنولوجيا التصوير RNA من حيث سهولة الاستخدام والخصوصية وسرعة رد الفعل. وهذه التقنية محدودة في المقام الأول من خلال الوقت الذي يستغرقه لتسمية العينة. يتطلب عدة التصوير RNA فترة الوسم 1 ساعة يمنع فحص التغيرات السريعة في الحمض النووي الريبي العالمية التي من شأنها أن تحدث عادة في غضون هذا الإطار الزمني. ولهذا السبب يقتصر لدينا نقطة لأول مرة إلى 1 ساعة و 15 دقيقة. ويرتبط تقنية مع قليل من القيود الأخرى التي تتعلق إلى حد كبير إلى كاشف التوافق مع علامات الفلورسنت الأخرى، على سبيل المثال، هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي غير متوافق مع تلطيخ phalloidin.
وتستند جميع النهج الحالي لدراسة تخليق الحمض النووي الريبي في الخلايا على إدماج النيوكليوسيدات تعديل فيالحمض النووي الريبي الوليدة وكشف عن تسميات أدرجت بوسائل مختلفة. واستند النهج الرائد على استخدام السلائف الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع تليها الكشف مع تصوير الإشعاع الذاتي. أدت هذه الطريقة إلى اكتشاف مراحل دورة الخلية والنتائج الهامة الأخرى؛ ومع ذلك، فإنه لديه الكثير من العيوب مثل طبيعة مرهقة من العمل الإشعاعي، مرات التعرض الطويل والصور منخفضة الدقة من تصوير الإشعاع الذاتي 6. تقدم المقبلة في مجال استغلال وسائل كيمياء مناعية للقضاء على ضرورة النشاط الإشعاعي. وقد وصفت من قبل RNA إدماج برو تليها الكشف كيمياء مناعية. ومع ذلك، الأجسام المضادة كفاءة الربط المطلوبة تمسخ الحمض النووي لتحسين فرص الحصول على الحمض النووي الريبي أو التي تسببت في فقدان مورفولوجيا الخلايا وتلف الحواتم من العديد من البروتينات، ومنع مزيد من الكشف عنها مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى 13. إدخال التكنولوجيا 'نقرة الكيمياء "مبسطة الخطوة الكشف ورانه إجراء مقارنة لتصوير الإشعاع الذاتي وكيمياء مناعية. وتستند هذه التقنية على أزيد-آلكاين Huisgen إضافة حلقية رد فعل حيث آلكاين محطة من 5 ethyniluridine يتحد مع أزيد مترافق مع fluorophore في وجود النحاس (I). رد فعل غير محددة، السريع، لا يتطلب أي خطوات إضافية، ومتوافق بسهولة مع الكشف عن immunochemical من مكونات الخلية الأخرى.
باستخدام هذه التكنولوجيا التصوير RNA أظهرنا أن الخلايا، في نفس السكان أحادي الطبقة، لديهم مستويات مختلفة توليف الحمض النووي الريبي في استجابة لنقص الأكسجة. نحن تقييد تجربتنا لدراسة تأثير إنتاج الحمض النووي الريبي فقط؛ ومع ذلك، فمن الممكن تماما مع هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي لأداء المعدلة، ردود فعل متعددة إضافية تسمح لإجراء تحليل أكثر تعقيدا من إنتاج الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، وتلطيخ الثانوية باستخدام الأجسام المضادة المحددة للعلامات من النسخ النشطة مثل مستويات الحمض النووي الريبي بوليميراز فسفرته الثاني أو حتى مكونات translaآلات نشوئها لتعطي مؤشرا لمقدار هذا الحمض النووي الريبي المنتجة حديثا أن يتم تحويلها إلى بروتين ممكنة. يمكن اختبار البروتينات إضافية، مثل أكتين، وهو البروتين الذي لا ينبغي أن تتغير بشكل ملحوظ مع نقص الأكسجة، كعنصر تحكم إضافية. علاوة على ذلك، يمكن اختبار أنواع مختلفة من الخلايا، كما أنه من المرجح جدا أن الخلايا المختلفة سوف يكون مختلفا معدلات تخليق الحمض النووي الريبي وحتى استجابات مختلفة لنقص الأكسجة.
استخدام هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي واضحة تماما شريطة أن يتم تنفيذ الخطوات كما هو موضح. الخطوات الحاسمة في البروتوكول ينطوي الطلاء الخلية، تثبيت الخلية وتلطيخ والحصول على الصور. من المهم أن لوحة الخلايا في كثافة وصفها لمنع فوق أو تحت التقاء في التجريب والتي سوف تؤثر تأثيرا كبيرا على النتيجة. من المهم أيضا لاستخدام تثبيتي الطازجة، وضمان أفضل 'قطة' من الخلية يؤخذ واتخاذ الحيطة والحذر عند غسل الخلايا بعد تلطيخ للحد من البكالورياkground إلى مستوى مقبول لتحليل كفاءة. أخيرا، وطريقة الحصول على الصور أمر في غاية الاهمية لتحقيق الصور التي هي من نوعية جيدة بما فيه الكفاية لتحليلها لاحقا. نوصي باستخدام أفضل مجهر الضوء المتاح لفحص عينات مثل بصريا كما المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول والذي يتوفر في معظم مراكز الأبحاث المكثفة على الصعيد العالمي.
The authors have nothing to disclose.
JB هو CRUK زميل السريرية، وكما هو الطالب ويلكوم ترست دكتوراه، ويتم تمويل المختبر ريال عن طريق زمالة أبحاث أول CRUK (C99667/A12918). وأيد هذا العمل من قبل اثنين من ويلكوم ترست جوائز الاستراتيجية (097945/B/11/Z و095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |