אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.
היפוקסיה או הפחתה של זמינות החמצן מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים רבים ופתולוגיים. ברמה המולקולרית, תאים ליזום תכנית תעתיק מסוימת על מנת לעלות תגובה תאית מתאימה ומתואמת. התא בעל כמה אנזימי חיישן חמצן שדורשים חמצן מולקולרי כcofactor לפעילות שלהם. אלה נעים בין prolyl-hydroxylases לdemethylases היסטון. רוב מחקרי ניתוח תגובות תאיות להיפוקסיה מבוססים על אוכלוסיות סלולריות ומחקרי ממוצע, וכניתוח תא בודד כזה של חוסר חמצן בתאים מבוצעים רק לעתים רחוקות. כאן אנו מתארים שיטת ניתוח של סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא והתא בהיפוקסיה באמצעות ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר, ואחריו ניתוח מיקרוסקופית וכימות. שימוש בתאי סרטן שנחשפו לחוסר חמצן לאורכים שונים של זמן, RNA מסומן ונמדד בכל תא. ניתוח זה מאפשרההדמיה של ושינויי תא אל התא זמניים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות לחץ חוסר חמצן.
היפוקסיה (מתחים נמוכים של חמצן) מתרחשת כאשר אספקת החמצן הרגילה לרקמה היא מופרעת. חמצן סביבתי הוא גם מזין ומולקולת איתות, מתן רמזים חשובים עבור סוגים רבים של תאים. שינויים בחמצן סביבתי הם חשו על ידי קבוצה של dioxygenases ששולטים על פעילותם של בני משפחה גורם שעתוק חיוני המכונים גורמי היפוקסיה העין מתנהלת (HIFs). HIFs מורכב משתי תת יחידות, α וβ. ישנם שלושה isoforms הידוע של HIF-α (1, 2, ו -3) וגרסאות אחוי מרובות של HIF-1β. HIF-1β מתבטאים constitutively ולא מוסדרים על ידי רמות חמצן סביבתיות 1. בני משפחת HIF-α מוסדרים באופן דינמי על ידי כיתה של prolyl-hydroxylases (תואר דוקטור) והגורם המעכב HIF (FIH); שניהם דורשים חמצן כשיתוף גורם לזרז הידרוקסילציה של HIF-α 2,3. בnormoxia בני משפחת HIF-α הם hydroxylated ומתויגים לproteosomאל השפלה ידי E3-האנזים, פון היפל לינדאו (VHL). בהיפוקסיה הדוקטורים וFIH אינם פעילים או שיש פעילות מופחתת. Isoforms HIF-α הפך התייצב, יוצר heterodimer עם HIF-1β, ולהשפיע על השעתוק של גנים המספקים את התגובה התאית לסביבת חוסר חמצן (איור 1 א) 4.
טכניקות הנוכחיות לניתוח RNA להתמקד בכימות של ערכים בממוצע על פני אוכלוסיית תא נתון. תאים מגיבים לגירוי חוסר חמצן על ידי ייזום השעתוק של מספר עצום של גנים המאפשרים להם להסתגל לסביבה העוינת שלהם 5. עם זאת, לעתים קרובות קיימת היפוקסיה כשיפוע, ותאים בסביבת חוסר חמצן אינם כפופים לגירוי חוסר חמצן אחיד. אנו מתארים יישום של ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר כדי לבחון סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא הבודד בהיפוקסיה.
ערכת ההדמיה RNA משתמשתנוקלאוזידים הותאם-lkyne, uridine 5-ethynyl (EU) וקשירת chemoselective כדי לאפשר זיהוי של סינתזת RNA הגלובלית temporally ומרחבית בתאים וברקמות 6. בקצרה, טיפול בתאים עם חוסר חמצן ותרבית בנוכחות של איחוד אירופי. לאחר מכן הם קבועים וpermeabilized וההתאגדות של האיחוד האירופי לרנ"א המתהווה הוא זוהה על ידי קשירת chemoselective של איחוד אירופי עם צבע המכיל אזיד. עבודה אופיינית לתגובה זו מוצגת באיור 1. אנחנו השתמשנו בערכת ההדמיה RNA לבחון סינתזת RNA ברמת התא הבודד שנבעה מטיפול בחוסר חמצן.
גדליו הקטנים של תג alkyne מאפשרים שילוב יעיל של נוקלאוזידים שונה לתוך RNA באופן ספציפי. קשירת chemoselective או התגובה 'קליק' היא יעילה ביותר, מהירה וספציפית 7-10. כל מרכיבי התגובה הם bioinert והתגובה לא דורשת טמפרטורות או ממסים קיצוניים. תגובת הלחיצה שוללתהדרישה לradiolabelling קונבנציונלי ומאפשר הדמיה ישירה של התוצאות שכן התפוקה היא אור. בנוסף לכך, מולקולת זיהוי יכולה לחדור בקלות דגימות מורכבות המאפשרות ניתוח זמנית כוללים נוגדנים לזיהוי של חלבוני RNA-אינטראקטיבי. assay ההדמיה RNA זה תואם עם צבעים אורגניים, כולל Alexa פלואוריד והעמסה (FITC).
מדדנו את השינוי בסינתזת RNA לאחר טיפול של התאים שלנו באמצעות יישום של הסביבה הפתוחה מיקרוסקופיה לעצמים מרוחקים (OMERO). OMERO הוא תוכנת קוד פתוח, זמינה בhttp://openmicroscopy.org/. תוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה מאפשרת גישה ולשימוש במגוון רחב של נתונים ביולוגיים, כולל הניהול של מערכי נתונים רב ממדיים, הטרוגנית. יישום לקוח מאפשר הדמיה וניתוח של נתוני תמונה ביולוגית מורכבים 11 מרחוק;אנחנו השתמשנו בו כדי לכמת את השינויים החזותיים בסינתזת RNA התא הגלובלית ורווקה. נתונים אלה ואת הצעדים הנדרשים כדי לנתח את ניסוי ההדמיה RNA שלנו באמצעות הדמיה זו מיקרוסקופ תמונה ותוכנת ניתוח מוצגים להלן.
הסתכלנו על שינויים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות הטיפול באוסטאוסרקומה אדם תאים (U2OS) עם היפוקסיה עד 24 שעה. בכל התנאים, זיהינו וריאציה תא אל התא ברמת ייצור RNA. זמנים קצרים של חשיפת היפוקסיה לא הביאו לשינויים משמעותיים ברמה של RNA המתהווה בתאים. עם זאת, חשיפה ל24 שעות של היפוקסיה הביאה לעלייה משמעותית בכמות של RNA המיוצרת בתאים. רוב התגובות תאיות להיפוקסיה נמדדים הבא תקופות ממושכות של חשיפה, כגון 4-24 שעה. עם זאת, הם הכניסו כמה מנגנונים במקום הרבה יותר מוקדם, למשל; הפעלת NF-κB מתרחשת בתוך 5-15 דקות של חשיפת היפוקסיה 12. חוקר היפו קצר יותרזמני חשיפת שיה הוא מוצדקים ולכן ויכולים לגרוע מתגובות מורכבות יותר כגון מחזור התא ואפופטוזיס.
שתארנו השימוש שלנו בערכת הדמיה RNA כדי לבחון את ההשפעות של חוסר חמצן בסינתזת RNA בתאי אוסטאוסרקומה (U2OS). טכניקה זו היא פשוטה יחסית, ומספקת נתונים על שעתוק הגלובלי ברמת תא בודדת. אנחנו שינינו את הפרוטוקול הקונבנציונלי עבור ערכה זו לשלב תיוג בתא היפוקסיה. למיטב ידיעתנו זה הדו"ח הראשון של השימוש בטכניקה זו כדי למדוד שינויים בסינתזת RNA בהיפוקסיה. ערכת ההדמיה RNA השתמשנו מתאימה לניסויים בהיפוקסיה שכן הוא לא דורש איזוטופים רדיואקטיביים והוא מבחינה טכנית בקנה אחד עם המגבלות של עבודה בתחנת עבודה באווירה מבוקרת. בעיות נפוצות בקיבעון הזה הדאגה טכניקה יעיל וסימון של המדגם. זה חשוב מאוד כי PFA משמש כדי לתקן את המדגם הוא טרי והצעדים לשטוף שבצעו את התגובה 'קליק' מבוצעים כפי שתוארו על מנת להבטיח מכתים רקע נמוך של המדגם. אם בackground הקרינה הופכת לבעיה מומלץ לשטוף שוב עם חיץ שטיפת תגובת ערכת ההדמיה RNA מיליליטר 1 לאחר שלב 2.7.4.
ערכת ההדמיה RNA שהוזכר כאן מייצגת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית ההדמיה RNA במונחים של קלות שימוש וספציפיות ומהירות התגובה. טכניקה זו היא מוגבלת בעיקר על ידי הזמן שנדרש כדי לתייג את המדגם. ערכת ההדמיה RNA דורשת תקופת תיוג 1 שעות שמונעת הבדיקה של שינויים מהירים בRNA הגלובלי, כי בדרך כלל היה להתרחש בפרק זמן זה. זה מסיבה זו נקודת הזמן הראשון שלנו מוגבלת לשעה 1 ו15 דקות. הטכניקה קשורה עם כמה מגבלות אחרות שמידה רבה מתייחסות למגיב תאימות עם סמני ניאון אחרים, למשל, ערכת ההדמיה RNA זה אינה תואמת עם מכתים phalloidin.
כל הגישות הקיימות של לימוד סינתזת RNA בתאים מבוססות על שילוב של nucleosides שונה לתוךRNA המתהווה וזיהוי של תוויות משולבות על ידי אמצעים שונים. הגישה החלוצית הייתה מבוססת על שימוש בסימנים מקדימים RNA שכותרתו רדיואקטיבית ואחרי זיהוי עם autoradiography. שיטה זו הובילה לגילוי של שלבי מחזור התא וממצאים חשובים אחרים; עם זאת, יש לו הרבה חסרונות כגון האופי המסורבל של עבודת רדיואקטיביות, זמן חשיפה ארוך ותמונות ברזולוציה נמוכות של autoradiography 6. מראש הבאים בתחום ניצל אמצעי immunochemistry לחסל את הצורך של רדיואקטיביות. RNA היה מתויג על ידי שילוב של הבר ואחריו גילוי immunochemistry. עם זאת, המחויב נוגדן יעיל denaturation חומצות גרעין כדי לשפר את הגישה ל-DNA או RNA שגרם לאובדן של מורפולוגיה של תאים פגומים אפיטופים של חלבונים רבים, מניעת הגילוי נוסף שלהם עם נוגדנים שכותרתו fluorescently 13. כניסתה של טכנולוגיה של כימיה לחץ "פישטה את צעד זיהוי ולאהוא הליך בהשוואה לautoradiography וimmunochemistry. הטכנולוגיה מבוססת על אזיד-alkyne תגובת cycloaddition Huisgen בי alkyne מסוף של 5-ethyniluridine נקשר עם אזיד מצומד עם fluorophore בנוכחות של Cu (I). התגובה ספציפית, מהירה, אינו דורשת כל צעדים נוספים, והוא בקלות בקנה אחד עם גילוי immunochemical של מרכיבי תא אחרים.
שימוש בטכנולוגיית ההדמיה RNA זה הראו שתאים, באותה האוכלוסייה monolayer, יש רמות סינתזת RNA שונות בתגובה להיפוקסיה. אנחנו מוגבלים הניסוי שלנו כדי לבחון את ההשפעה של ייצור RNA בלבד; עם זאת, הוא מלא אפשרי עם ערכת ההדמיה RNA זה כדי לבצע הותאמו תגובות זמנית נוספות, המאפשרות ניתוח מורכב יותר של ייצור RNA. לדוגמא, מכתים המשני באמצעות נוגדן ספציפי לסמנים של שעתוק פעיל כגון רמות של פולימראז פוספורילציה RNA השני או אפילו רכיבים של התרגומיםמכונות tion לתת אינדיקציה לכמות של RNA הפיק החדש הזה שהופך לחלבון אפשריות. חלבונים נוספים, כגון אקטין, חלבון זה לא צריך לשנות באופן משמעותי עם היפוקסיה, יכולים להיבדק כבקרה נוספת. יתר על כן, סוגי תאים שונים יכולים להיבדק, כפי שהוא מאוד סביר להניח כי תאים שונים יהיו תעריפים שונים RNA סינתזה ואפילו תגובות שונות להיפוקסיה.
שימוש בערכת ההדמיה RNA זה הוא פשוט למדי סיפק את הצעדים מבוצעים כפי שתואר. שלבים קריטיים בפרוטוקול כרוך ציפוי תא, קיבוע תא מכתים ורכישת תמונה. חשוב צלחת התאים בצפיפות תיארה כדי למנוע מעל או מתחת לנקודת מפגש בניסויים אשר תשפיע על התוצאה באופן משמעותי. כמו כן, חשוב להשתמש במקבע טרי, כדי להבטיח את "תמונת המצב" הטובה ביותר של התא נלקח ולטפל בעת שטיפת התאים לאחר הצביעה כדי לצמצם את בחינות הבגרותkground לרמה שמקובלת לניתוח יעיל. לבסוף, שיטת רכישה של תמונה היא חשובה וחיוני על מנת להשיג תמונות כי הם באיכות מספיק טובה לניתוח שלאחר מכן. אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ האור הטוב ביותר העומד לרשות לבחון דגימות אופטית כגון מיקרוסקופ שימוש בפרוטוקול זה שהוא זמין ברוב מרכזי המחקר האינטנסיביים ברחבי העולם.
The authors have nothing to disclose.
JB הוא עמית קליני CRUK, כתלמיד Wellcome Trust PhD, המעבדה SR ממומנת על ידי מלגת מחקר בכירה CRUK (C99667/A12918). עבודה זו נתמכה על ידי שני פרסים Wellcome Trust אסטרטגיים (097945/B/11/Z ו095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |