Summary

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Published: April 02, 2014
doi:

Summary

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

Abstract

La respuesta inmune del huésped a patógenos es un proceso biológico complejo. La mayoría de los estudios in vivo empleado clásicamente para caracterizar las interacciones huésped-patógeno se aprovechan de inyecciones intraperitoneales de seleccionar las bacterias o los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) en ratones. Si bien estas técnicas han rendido enormes de datos relacionados con patobiología enfermedad infecciosa, los modelos de inyección intraperitoneal no siempre son apropiadas para estudios de interacción huésped-patógeno en el pulmón. Utilizando un modelo de inflamación pulmonar aguda en ratones, es posible llevar a cabo un análisis de alta resolución de la respuesta inmune del huésped innata la utilización de lipopolisacárido (LPS). A continuación, describimos los métodos para administrar el uso de la administración intratraqueal LPS orofaríngea no quirúrgico, el seguimiento de parámetros clínicos asociados con la patogénesis de la enfermedad, y utilizar el líquido de lavado broncoalveolar para evaluar la respuesta inmune del huésped. Las técnicas que se describenson ampliamente aplicables para el estudio de la respuesta inmune innata de acogida a un rango diverso de PAMP y patógenos. Del mismo modo, con pequeñas modificaciones, estas técnicas pueden también ser aplicadas en los estudios que evalúan la inflamación de las vías respiratorias alérgica y en aplicaciones farmacológicas.

Introduction

Las infecciones pulmonares asociadas a especies de bacterias patógenas son una causa frecuente de morbilidad y mortalidad global. La determinación de los mecanismos que conducen a la respuesta inmune del huésped a estos patógenos, promoverá el desarrollo de estrategias de prevención novedosas y agentes terapéuticos que atenuar el impacto de estas infecciones. El objetivo general del protocolo descrito aquí es proporcionar al usuario un método flexible para evaluar la respuesta inmune innata huésped a la infección del patógeno utilizando un patrón molecular asociado patógeno (PAMP) como un sustituto de bacterias vivas. La mayoría de los estudios previos de evaluación de la respuesta inmune innata de acogida a las bacterias se han centrado en modelos peritoneales debido a la relativa facilidad de ejecución. Aunque estos modelos son muy útiles y han dado lugar a avances significativos en el campo de las interacciones huésped-patógeno y la inflamación sistémica, los datos generados a partir de estos modelos no siempre son apropiadas para estudios involving el sistema respiratorio. Aquí, un modelo pulmonar de la inflamación pulmonar aguda se propone como una expansión práctico y clínicamente relevante de los modelos de inyección clásicos intraperitoneal (ip). La técnica propuesta permite la evaluación local de la respuesta inmune innata en un sistema de modelo específico de órganos.

Los métodos descritos aquí se han diseñado para proporcionar una técnica simple y robusto para permitir a los usuarios evaluar la respuesta inmune del huésped a LPS, que es un PAMP común. Los métodos se basan en intratraqueal (IT) de la instilación de LPS, que induce una respuesta inmune innata robusto en los pulmones de los ratones y imita muchas de las características fisiopatológicas observadas en los pacientes humanos que sufren de infecciones respiratorias y la lesión pulmonar aguda 1. Una ventaja principal de esta técnica es que permite al usuario evaluar la respuesta inmune del huésped y sin los factores de confusión y problemas de seguridad asociados con la realización de estudios in vivoel uso de bacterias vivas. Del mismo modo, la vía de administración que orofaríngea de la exposición descrita en este protocolo tiene ventajas significativas sobre otras técnicas comúnmente utilizadas, incluyendo intranasal (in) administración y gestión se quirúrgico. Por ejemplo, la administración que orofaríngea permite la dosificación relativamente precisa y la deposición de pulmón en comparación con en la administración, que típicamente sufre de aumento de la variabilidad de la deposición en los pulmones debido a la pérdida de agentes en la cavidad nasal y los senos paranasales 2-4. La vía de administración, elude estas cavidades y permite el acceso directo a la tráquea y las vías respiratorias. Del mismo modo, el enfoque que se quirúrgica es un método de administración mucho más morboso y requiere una amplia formación de dominar. Los protocolos descritos aquí también incluyen una descripción de las técnicas comunes y marcadores indirectos utilizados para evaluar la progresión de la inflamación y terminar con un protocolo que describe las técnicas adecuadas para la preparación de la luones para las evaluaciones de histopatología. Estos protocolos se centran en reducir al mínimo el número de ratones requeridos para cada estudio mediante la maximización de los datos generados a partir de cada animal individual.

Los protocolos descritos son altamente flexibles y pueden ser fácilmente modificados para evaluar una diversa gama PAMPs y los daños asociados a patrones moleculares (apaga). Por otra parte, con algunas modificaciones, estos protocolos también pueden ser aplicados a los estudios que evalúan la progresión de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas o interacciones huésped-patógeno con bacterias vivas, virus u hongos 5-10.

Protocol

Se realizaron todos los estudios bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso (IACUC) de Virginia Tech y de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Intratraqueal (it) La inoculación de LPS mediante Administración de orofaringe Asegúrese de que cada animal se identifica unívocamente usando un punzón oído, marca auricular, u otro método aprobado institucionalmente. Anotar el…

Representative Results

Las paredes celulares de las bacterias gram-negativas se componen de LPS, que es altamente abundante en el medio ambiente. La inhalación de LPS en las poblaciones humanas sensibles exacerba la reactividad de las vías respiratorias y es capaz de desencadenar una response11 inmune robusta. LPS es también un PAMP común utilizado en modelos de ratón para provocar una respuesta inmune innata robusta. En el protocolo descrito aquí, los ratones recibieron una dosis de LPS es aislado a partir de E. coli (serotipo…

Discussion

Los pasos más importantes para evaluar con éxito la respuesta inmune del huésped en los pulmones del ratón es el siguiente: 1) elegir la cepa de ratón apropiado y sexo para el modelo que se está evaluando; 2) optimizar la entrega de PAMP a los pulmones; 3) recopilar y procesar correctamente la BALF; y 4) fijan correctamente y preparar los pulmones para las evaluaciones histopatológicas.

La elección de la cepa de ratón es un factor importante en la evaluación de la respuesta inmune …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a la Universidad Regional del VA-MD de la medicina veterinaria para proporcionar núcleo y soporte técnico para este proyecto. Este trabajo es apoyado por un premio de Desarrollo Profesional de los NIH (K01DK092355).

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

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Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

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