Summary

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Published: April 02, 2014
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Summary

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

Abstract

A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis ​​para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.

Introduction

As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospedeiro natural para as bactérias têm-se centrado em modelos peritoneal devido à relativa facilidade de execução. Embora estes modelos são muito úteis e têm resultado em avanços significativos no campo das interações patógeno-hospedeiro e inflamação sistêmica, os dados gerados a partir desses modelos nem sempre são adequadas para estudos involving do sistema respiratório. Aqui, um modelo pulmonar de inflamação pulmonar aguda é proposto como uma expansão prático e clinicamente relevante dos intraperitoneal (ip) de injeção de modelos clássicos. A técnica proposta permite a avaliação local da resposta imune inata em um sistema modelo específico do órgão.

Os métodos descritos aqui são projetados para fornecer uma técnica simples e robusta para permitir que os usuários para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS, que é um PAMP comum. Os métodos baseiam-se na via intratraqueal (it) instilação de LPS, que induz uma resposta imune inata robusta nos pulmões dos ratos e imita muitas das características fisiopatológicas observadas em pacientes humanos que sofrem de infecções respiratórias e lesão pulmonar aguda 1. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao usuário avaliar a resposta imune do hospedeiro, sem os fatores de confusão e problemas de segurança associados à realização de estudos in vivoutilizando bactérias vivas. Do mesmo modo, a via de administração que orofaríngea de exposição descrito neste processo tem vantagens significativas sobre outras técnicas geralmente utilizadas, incluindo intranasal (em) a administração e que a administração cirúrgica. Por exemplo, ele permite que a dosagem de administração orofaríngea relativamente preciso e deposição nos pulmões em comparação com a administração, que normalmente sofre de um aumento da variabilidade da deposição nos pulmões, devido à perda de agentes na cavidade nasal e os seios 2-4. A rota que contorna administração destas cavidades e permite acesso direto à traquéia e vias aéreas. Da mesma forma, a abordagem cirúrgica que é um método de administração significativamente mais mórbida e requer extenso treinamento para dominar. Os protocolos descritos aqui também incluir uma descrição das técnicas comuns e marcadores substitutos utilizados para avaliar a progressão da inflamação e termina com um protocolo descrevendo as técnicas apropriadas para a preparação da lungs para avaliações de histopatologia. Estes protocolos são focados em minimizar o número de ratinhos necessários para cada estudo, maximizando os dados gerados a partir de cada animal.

Os protocolos descritos são altamente flexível e pode ser facilmente modificado para avaliar uma diversificada gama PAMPs e padrões moleculares danos associados (amortece). Além disso, com algumas modificações adicionais, estes protocolos podem também ser aplicadas a estudos de avaliação das vias aéreas alérgica progressão da doença ou interações patógeno-hospedeiro com bactérias vivas, vírus ou fungos 5-10.

Protocol

Todos os estudos foram realizados no âmbito da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) para Virginia Tech e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Intratraqueal (IT) A inoculação de LPS usando a administração orofaríngea Certifique-se de que cada animal é identificado exclusivamente usando um soco ouvido, marca auricular, ou outro método aprovado institucionalmente. Regi…

Representative Results

As paredes celulares de bactérias gram-negativas são compostos de LPS, o que é muito abundante no ambiente. A inalação de LPS em populações humanas sensíveis exacerba a reactividade das vias aéreas e que é capaz de desencadear uma response11 imune robusta. LPS é também um PAMP comum utilizado em modelos de ratinho para induzir uma resposta imune inata robusta. No protocolo aqui descrito, os ratos receberam uma dose que de LPS isolado a partir de E. coli (sorotipo 0111: B4) usando-administração oro…

Discussion

Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas.

A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipica…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Faculdade Regional VA-MD da medicina veterinária para a prestação de núcleo e suporte técnico para este projeto. Este trabalho é apoiado por uma NIH Career Award Desenvolvimento (K01DK092355).

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

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Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

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