Summary

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

Published: April 02, 2014
doi:

Summary

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

Abstract

התגובה החיסונית המארח לפתוגנים היא תהליך ביולוגי מורכב. רוב במחקרי vivo מועסק קלסי לאפיין אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן לנצל את זריקות intraperitoneal של חיידקים בחרו או דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs) בעכברים. בעוד טכניקות אלה הניבו נתונים עצומים הקשורים pathobiology מחלות זיהומיות, מודלים זריקת intraperitoneal הם לא תמיד מתאימים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן בריאות. ניצול מודל דלקת ריאות חריף בעכברים, ניתן לבצע ניתוח ברזולוציה גבוה של מארח תגובה חיסונית מולדת ניצול lipopolysaccharide (LPS). כאן, אנו מתארים את השיטות לניהול LPS באמצעות ממשל intratracheal הלוע התחתון לא נזקק לניתוח, לעקוב אחר פרמטרים קליניים הקשורים להיווצרות מחלה, ולנצל את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית כדי להעריך את התגובה החיסונית המארחת. הטכניקות המתוארותחלים נרחב ללימוד התגובה החיסונית המולדת המארח למגוון רחב של PAMPs ופתוגנים. כמו כן, עם שינויים קלים, יכולות להיות מיושמות גם בטכניקות אלה במחקרים להערכת דלקת בדרכי הנשימה ואלרגיות ביישומים תרופתיים.

Introduction

דלקות ריאה הקשורים למיני חיידקים פתוגניים הם גורמים שכיחים לתחלואה ותמותה בעולם. קביעת המנגנונים המניעים את התגובה החיסונית המארחת לפתוגנים אלה יהיו לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות חדשניות למניעה וסוכנים טיפוליים שיהיה להחליש את ההשפעה של זיהומים אלה. המטרה הכללית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק את המשתמש עם שיטה גמישה כדי להעריך את התגובה החיסונית המולדת המארח לזיהום הפתוגן באמצעות דפוס הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMP) כתחליף לחיידקים חיים. רוב המחקרים הקודמים להערכת התגובה החיסונית המולדת לחיידקי המארח התמקדו בדגמי הצפק בשל הקלות היחסית של ביצוע. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד והביאו להתקדמות משמעותית בתחום של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ודלקת מערכתית, הנתונים המופקים ממודלים אלה לא תמיד מתאימים ללימודים involving מערכת הנשימה. הנה, מודל ריאות של דלקת ריאות חריפה מוצע כהרחבה מעשית ורלוונטית קליני של המודלים הזרקה (IP) intraperitoneal הקלאסיים. הטכניקה המוצעת מאפשרת להערכה המקומית של תגובת החיסון המולדת במערכת מודל ספציפית איברים.

השיטות שתוארו כאן נועדו לספק טכניקה פשוטה וחזקה כדי לאפשר למשתמשים להעריך את התגובה החיסונית המארחת לLPS, שהוא PAMP משותף. השיטות מבוססות על intratracheal החדרה (את זה) של LPS, אשר גורם לתגובה חיסונית מולדת חזקה לריאות של עכברים ומחקה רבים מהתכונות pathophysiological נצפו בחולים אנושיים הסובלים מזיהומים בדרכי הנשימה ופציעת ריאות חריפות 1. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש להעריך את התגובה החיסונית המארחת בלי גורמי בלבול וחששות בטיחות הקשורים לביצוע במחקרי vivoשימוש בחיידקים חיים. כמו כן, יש מסלול ממשלו הלוע התחתון של חשיפה שתוארה בפרוטוקול זה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות מנוצלים בדרך כלל, כוללים אפי (ב) ממשל ומנהלו כירורגית. לדוגמא, ממשלו הלוע התחתון מאפשר dosaging מדויק יחסית ותצהיר ריאות בהשוואה בממשל, אשר בדרך כלל סובל מהשתנות מוגברת של תצהיר ריאות עקב האובדן של סוכנים בחלל האף והסינוסים 2-4. מסלול הממשל עוקף חללים אלו ומאפשר גישה ישירה לקנה הנשימה ודרכי הנשימה. כמו כן, גישתה כירורגית היא שיטת ממשל באופן משמעותי יותר חולנית ודורשת הכשרה מקיפה להורים. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים גם תיאור טכניקות הנפוצות וסמנים פונדקאיות המשמשים להערכת התקדמות דלקת ומסתיים בפרוטוקול המתאר את הטכניקות המתאימות להכנת luNGS להערכות histopathology. פרוטוקולים אלה התמקדו במזעור מספר העכברים הנדרשים לכל מחקר על ידי למקסם את הנתונים המופקים מבעלי חיים הבודדים.

הפרוטוקולים שתוארו הם גמישים ביותר וניתן לשנות בקלות להעריך PAMPs מגוון רחב ודפוסי נזקים הקשורים מולקולריים (damps). יתר על כן, עם כמה שינויים נוספים, יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים אלה למחקרים להערכת התקדמות מחלה בדרכי הנשימה אלרגיות או אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן עם חיידקים חיים, וירוסים או פטריות 5-10.

Protocol

כל המחקרים נערכו באישור הוועדה המוסדי לטיפול ושימוש (IACUC) לוירג'יניה טק ובהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. חיסון Intratracheal (את זה) של LPS באמצעות מנהל מלוע תחתון <li style=";text-ali…

Representative Results

דופן התא של חיידקי גרם שלילי מורכבים מLPS, שהוא נרחב ביותר בסביבה. שאיפה של LPS באוכלוסיות אנושיות רגישות מחריפה תגובתיות דרכי הנשימה ומסוגלת להפעיל response11 חיסונית חזק. LPS גם PAMP נפוץ בשימוש במודלים של עכבר כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת חזקה. בפרוטוקול מתואר כאן, העכברים ק…

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר להערכת התגובה החיסונית המארחת בריאות עכבר בהצלחה הוא כדלקמן: 1) לבחור את הזן המתאים עכבר ומין עבור הדגם נבדק; 2) לייעל את משלוח PAMP לריאות; 3) בצורה נכונה לאסוף ולעבד את בלף; ו -4) לתקן כראוי ולהכין של הריאות להערכות histopathological.

<p class="jove_content" style=";text-align…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים למכללה האזורית VA-MD ברפואת וטרינרית למתן תמיכת ליבה וטכנית עבור פרויקט זה. עבודה זו נתמכת על פיתוח קריירה פרס NIH (K01DK092355) על ידי.

Materials

C57Bl/6J The Jackson Laboratory Stock 000664
Compact Scale Ohaus Scale Corporation 71142845
Small Animal Rectal Thermometer Braintree Scientific TH 5
Rectal Probe for Rodents Braintree Scientific RET 3
Ear Punch Braintree Scientific EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 InvivoGen LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-023
Isoflurane Baxter 40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand ICAP Manufacturing n/a
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific RIS 100
Scissors (blunt/sharp) Fisher Scientific 13-806-2
forceps (straight) Fisher Scientific 22-327-379
forceps (45º, curved) Fisher Scientific 10-275
Scissors (blunt/blunt) Fisher Scientific 08-940
Pipette (200 µl Capacity) Gilson F123601
Ethanol Sigma 459844
 1 ml Syringe BD Medical 301025
10 ml Syringe BD Medical 301604
27 G x 0.5 in. needle BD Medical 305109
Refrigerated Microcentrifuge Fisher Scientific 13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter Harvard Apparatus 732836
Hank's Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture Ethicon A183
Luer to Tube Connector Kits Harvard Apparatus 721406
Luer Stopcock Kit Harvard Apparatus 721664
Tygon formula E-3603 laboratory tubing Sigma R-3603
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit BD Biosciences 560478
Hemacytometer Hausser Scientific 3520
Hemacytometer Cover Glasses Thermo Scientific 22-021-801 
Trypan Blue Thermo Scientific SV3008401
Cytology Funel Clips Fisher Scientific 10-357
Cytology Funels Fisher Scientific 10-354
Filter Cards Fisher Scientific 22-030-410
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
Cover Glasses Fisher Scientific 12-540A
Cytospin Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 
Diff Quick Staining Kit Fisher Scientific 47733150
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-500

References

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

Play Video

Cite This Article
Allen, I. C. The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice. J. Vis. Exp. (86), e51391, doi:10.3791/51391 (2014).

View Video