Excitotóxica Estimulación del cerebro Microslices como<em> In vitro</em> Modelo de Carrera
Summary
Hemos desarrollado un modelo de cortes de cerebro que se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada. Esta técnica genera tejido cerebral madura viable y reduce el número de animales necesarios para la experimentación, mientras que mantiene los circuitos neuronales, las interacciones celulares y compartimentos postsinápticos parcialmente intacta.
Abstract
El examen de los mecanismos moleculares implicados en condiciones neuropatológicos, tales como accidente cerebrovascular isquémico, puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como sistemas de cultivo neuronal '-como' células tales, primaria o se utilizan comúnmente. Si bien estos sistemas son relativamente fáciles de trabajar con, y son sistemas modelo útil en el que diversos resultados funcionales (tales como la muerte celular) pueden cuantificarse fácilmente, los resultados examinados y vías en neuronas inmaduras cultivadas (tales como vías de la muerte celular mediada por excitotoxicidad-) no son necesariamente los mismos que los observados en el cerebro maduro, o en el tejido intacto. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos en los que los mecanismos celulares en el tejido neural madura puede ser examinado. Hemos desarrollado una técnica in vitro que se puede utilizar para investigar una variedad de vías moleculares en el tejido nervioso intacto. La técnica descrita en este documento utiliza tejido cortical de rata, pero esta técnica se puede adaptar para utilizar el tejidoa partir de una variedad de especies (tales como ratón, conejo, conejillo de indias, y pollo) o regiones del cerebro (por ejemplo, hipocampo, cuerpo estriado, etc.) Además, una variedad de estímulos / tratamientos se puede utilizar (por ejemplo, excitotoxicidad, la administración de inhibidores, etc). En conclusión, el modelo de cortes de cerebro se describe en el presente documento puede usarse para examinar una variedad de mecanismos moleculares implicados en la lesión cerebral excitotoxicidad mediada.
Introduction
La forma más común de accidente cerebrovascular es el accidente cerebrovascular isquémico, que se produce cuando un vaso sanguíneo cerebral se ocluye. La isquemia tisular que resulta de la cesación del flujo de sangre causa la despolarización de las membranas generalizada, liberación de neurotransmisores excitadores, y la elevación sostenida de calcio intracelular, lo que conduce a la activación de la muerte celular pathways 1. Este proceso ha sido denominado 'excitotoxicidad', y es una vía común implicado en la muerte neuronal producida por una variedad de patologías, incluyendo accidente cerebrovascular 2. La inhibición de las vías de señalización implicadas en la excitotoxicidad y otras cascadas de muerte celular neuronal es un enfoque atractivo para limitar el daño neuronal después de un accidente cerebrovascular.
La identificación de los mecanismos moleculares exactos involucrados en la excitotoxicidad y el ictus isquémico puede ser difícil cuando se utilizan sistemas de animales enteros. Como tal, embrionaria primaria y 'tipo neuronal "(por ejemplo neuroblastoma y de adenocarcinoma de líneas inmortalizadas) se utilizan a menudo sistemas de cultivo celular. Las principales ventajas de estos modelos es que son fáciles de manipular, relativamente rentable, y la muerte celular se pueden medir fácilmente y se cuantificaron. Sin embargo, las vías de señalización pueden ser alterados por las condiciones de cultivo utilizadas 3,4, y las neuronas inmaduras y líneas inmortalizadas pueden expresar diferentes receptores y moléculas de señalización en comparación con madurar cerebro 5-8. Además, las neuronas cultivadas sólo permiten el examen de un tipo de célula (o dos, si se utiliza un sistema de cocultivo), mientras que el tejido cerebral intacta es heterogéneo, que contiene una variedad de tipos de células que interactúan entre sí. También se utilizan sistemas de cultivo de cortes organotípicos (explantes delgadas de tejido cerebral), y estos modelos permiten el estudio de poblaciones heterogéneas de células como se encuentran in vivo. Sin embargo, sólo una cantidad limitada de tejido se puede obtener de cada animal cuando se utiliza esta técnica, las rebanadas puedeNo se cultivaron durante tanto tiempo como líneas celulares inmortalizadas, y medio para el cultivo a largo plazo puede dar lugar a alteraciones en las vías de señalización y los receptores en las rebanadas. Mientras que el cerebro madura puede ser utilizado para generar rebanadas organotípicos, rodajas de cerebro inmaduro son más susceptibles a la cultura, y son más comúnmente utilizados. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar modelos que imitan o representan cerebro maduro intacto, que son fáciles de usar, en la que las vías de señalización neuronales pueden ser examinados.
En la presente memoria, se describe una técnica in vitro que implica tejido nervioso intacto que se puede utilizar para elucidar los mecanismos moleculares implicados en la muerte celular después de un insulto excitotóxica o isquémica. Esta técnica reduce el número de animales necesarios para llevar a cabo un experimento, es reproducible, y genera tejido viable que se comporta de una manera similar a metabólicamente rebanadas organotípicos más grandes. Además, la circuitería neuronal, las interacciones celulares, y co postsinápticampartment permanece parcialmente intacta. El tampón fisiológico utilizado permite que las membranas celulares para 'resellado ", y permite que las células recuperan su resistencia de la membrana 9 original. Este modelo de cortes de cerebro es capaz de imitar fielmente respuestas observadas después de la excitotoxicidad mediada por lesiones cerebrales 10, y se puede utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en el accidente cerebrovascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la presente memoria, se describe una técnica in vitro para la generación de microslices que se pueden utilizar para examinar los mecanismos moleculares implicados en la excitotoxicidad y muerte celular mediada por la isquemia en el tejido cerebral madura intacta. Esta técnica produce tejido viable (Figuras 1-3), que es metabólicamente similar a rebanadas organotípicos más grandes 15. Además, este modelo MicroSlice corresponde estrechamente a la respuesta observada …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación de la Salud y medicina Consejo de Investigación Nacional de Australia, el Instituto de Investigación Médica de Hunter, y la Universidad de Newcastle.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
