הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em> במבחנה</em> דגם של שבץ
Summary
פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.
Abstract
בחינת מנגנונים מולקולריים מעורבים בתנאי נוירו, כגון שבץ איסכמי, יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה, ראשוני או מערכות 'דמויות עצביות "תא התרבות נמצאת בשימוש נרחב. בעוד שמערכות אלה קלות יחסית לעבוד איתו, ומערכות שימושיות מודל שבו תוצאות שונות תפקודיות (כגון מוות של תאים) ניתן לכמת בקלות, את התוצאות הנבחנות ומסלולים בנוירונים בוגרים בתרבית (כגון מסלולי מוות של תאים בתיווך הפעלת יתר רעילה) אינם בהכרח זהים לאלו שנצפו במוח בוגר, או ברקמה שלמה. לכן, יש הצורך לפתח מודלים שבו ניתן לבחון את המנגנונים תאיים ברקמה עצבית בוגרת. פיתחנו טכניקה במבחנה שיכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מסלולים מולקולריים ברקמת עצבים בשלמותה. הטכניקה המתוארת במסמך זה מנצלת רקמת קליפת המוח חולדה, אך טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לשימוש רקמהממגוון רחב של מינים (כגון עכבר, ארנב, שפן ניסיונות, ועוף) או אזורים במוח (למשל, ההיפוקמפוס, סטריאטום, וכו '). בנוסף, מגוון רחב של גירויים / טיפולים יכול לשמש (לדוגמא, הפעלת יתר רעיל, ממשל של מעכבים, וכו '). לסיכום, מודל פרוסת המוח שתואר במסמך זה יכול לשמש כדי לבחון מגוון של מנגנונים מולקולריים המעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה.
Introduction
הצורה הנפוצה ביותר של שבץ היא שבץ איסכמי, אשר מתרחש כאשר כלי דם במוח הופך להיות חסומים. איסכמיה הרקמות שתוצאה מהפסקת זרימת דם גורמת לשלילת קוטביות נרחבת של ממברנות, שחרור שליחים עצביים מעוררים, והעלאה מתמשכת של סידן תוך תאי, מה שמוביל להפעלה של מוות של תאי מסלולי 1. תהליך זה זכה לכינוי 'הפעלת יתר רעילה', והוא מסלול משותף מעורב במוות עצבי המיוצר על ידי מגוון רחב של פתולוגיות, כולל שבץ 2. עיכוב של מסלולי האיתות מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומפלי מוות של תאים עצביים אחרים הוא גישה מושכת להגביל את הנזק עצבי בעקבות שבץ מוחי.
זיהוי המנגנונים המולקולריים המדויקים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ושבץ איסכמי יכול להיות קשה בעת שימוש במערכות של בעלי חיים כולה. ככזה עוברית ראשונית, ו( למשל neuroblasto 'כמו עצבי-'קווים הונצחו ma ואדנוקרצינומה) מערכות תרבית תאים משמשים לעתים קרובות. היתרונות העיקריים של הדגמים האלה הם שהם קלים לתפעול, יחסית חסכוני, ומוות של תאים ניתן למדוד בקלות ונרשמת. עם זאת, ניתן לשנות מסלולי איתות על ידי תנאי culturing משמשים 3,4, ונוירונים בוגרים והנציחו קווים יכולים לבטא קולטנים שונים ומולקולות איתות בהשוואה להבשיל מוח 5-8. יתר על כן, נוירונים בתרבית רק לאפשר הבדיקה של סוג תא אחד (או שתיים, אם נעשה שימוש במערכת coculture), ואילו רקמות מוח שלמות היא הטרוגנית, המכילות מגוון של סוגי תאים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני. מערכות פורסים תרבות Organotypic (explants הדק של רקמת המוח) משמשות גם, ומודלים אלה מאפשרים מחקר של אוכלוסיות הטרוגניות של תאים כפי שהם נמצאים בגוף חי. עם זאת, ניתן להשיג רק כמות מוגבלת של רקמות מכל בעל חיים בעת שימוש בטכניקה זו, פרוסות יכולותלא להיות מתורבת במשך זמן רב ככל שורות תאים הונצחו, ובינוני לתרבות לטווח הארוך יכול לגרום לשינויים במסלולי איתות וקולטנים בפרוסות. בעוד מוח בוגר יכול לשמש כדי ליצור פרוסות organotypic, פרוסות מהמוח בוגר הן נוחות יותר לתרבות, ויותר מנוצלים בדרך כלל. אין אפוא הצורך לפתח מודלים אשר לחקות או לייצג את המוח שלם בוגר, שהם קלים לשימוש, שבו ניתן לבחון את מסלולי איתות עצביים.
בזאת, חוץ גופית בטכניקה מעורבת ברקמת עצבים בשלמותה, שניתן להשתמש על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים המעורבים במותם של תאים הבאים עלבון הפעלת יתר רעיל או איסכמי מתוארת. טכניקה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים הנדרשים לביצוע ניסוי, הוא לשחזור, ויוצרת רקמת קיימא שמתנהגת בצורה מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדולות יותר. בנוסף, המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ושיתוף postsynapticmpartment נותר בשלמותה בחלקו. החיץ הפיזיולוגי המשמש מאפשר קרום התא ל'reseal ', ומאפשר לתאים להתאושש התנגדות הקרום המקורית שלהם 9. מודל פרוסת מוח זה מסוגל לחקות בנאמנות תגובות שנצפו בעקבות ניזק מוחי הפעלת יתר רעילה בתיווך 10, וניתן להשתמש בם כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בשבץ.
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת, טכניקה חוץ גופית בעבור הדור של microslices שיכול לשמש כדי לבחון את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהפעלת יתר רעילה ומוות של תאים בתיווך איסכמיה ברקמת מוח בוגרת בשלמותה הוא תאר. טכניקה זו מייצרת רקמת קיימא (איורים 1-3), שהיא מטבולית דומה לפרוסות organotypic גדו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מחקר מהמועצה הלאומית לבריאות והמחקר הרפואי של אוסטרליה, האנטר מכון המחקר הרפואי, ואוניברסיטת ניוקאסל.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
