Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em> В пробирке</em> Модель инсульта
Summary
Мы разработали модель ломтик мозга, который может использоваться для изучения молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга. Этот метод генерирует жизнеспособной зрелой ткани мозга и уменьшает количество животных, необходимых для экспериментов, в то время как сохранение нейронной цепи, клеточных взаимодействий и постсинаптические отсеков частично нетронутыми.
Abstract
Изучение молекулярных механизмов, участвующих в нейропатологических условиях, таких как ишемического инсульта, может быть трудно при использовании целые системы животных. Таким образом, первичный или "нейронов-подобные 'системах клеточных культур, как правило, используется. В то время как эти системы могут быть сравнительно легко работать, и являются полезными модельные системы, при которой различные функциональные результаты (например, гибели клеток) могут быть легко количественно, исследованные результаты и пути в культуре нейронов незрелых (например, эксайтотоксичность-опосредованной клеточной гибели путей) не обязательно те же, что наблюдается в зрелом мозге или в интактной ткани. Таким образом, существует необходимость в разработке модели, в которых клеточные механизмы в зрелом нервной ткани может быть рассмотрен. Мы разработали методику в пробирке, которую можно использовать, чтобы исследовать различные молекулярные пути в интактной нервной ткани. Методика использует описанные здесь ткани коры головного мозга крыс, но этот метод может быть адаптирован для использования тканииз различных видов (например, мыши, кролика, морской свинки, и курицы) или областях мозга (например, гиппокамп, стриатума и т.д.). Кроме того, разнообразие стимуляции / лечения можно использовать (например, эксайтотоксический, введение ингибиторов и т.д.). В заключение, модель мозг ломтик описано здесь, может быть использован для изучения различных молекулярных механизмов, участвующих в эксайтотоксичности-опосредованного повреждения головного мозга.
Introduction
Наиболее распространенной формой инсульта ишемического инсульта, который происходит, когда мозговой кровеносных сосудов становится окклюзии. Ткань ишемии, который возникает в результате прекращения кровотока приводит к широкому деполяризацию мембраны, высвобождение возбуждающих нейромедиаторов, и устойчивое повышение внутриклеточного кальция, что приводит к активации пути клеточной гибели 1. Этот процесс был назван "эксайтотоксичность ', и является общим путь вовлечен в гибели нейронов производится с помощью различных патологий, в том числе инсульта 2. Ингибирование сигнальных путей, участвующих в эксайтотоксичности и других нервных каскадов клеточной гибели является привлекательным подход ограничить повреждения нейронов после инсульта.
Выявление точные молекулярные механизмы, участвующие в эксайтотоксичности и ишемического инсульта может быть трудно при использовании целые системы животных. По существу, первичной эмбриональных и "нейронов, как '(например neuroblastoма и аденокарциномы иммортализованные линии) системы клеточных культур часто используются. Основные преимущества этих моделей в том, что они легко манипулировать, относительно экономически эффективным, и гибель клеток может быть легко измерены и количественно. Тем не менее, сигнальные пути могут быть изменены условий культивирования, используемых 3,4 и незрелых нейронов и увековечен линии могут экспрессировать различные рецепторы и сигнальные молекулы по сравнению с зрелые мозг 5-8. Кроме того, культивируемые нейроны только позволит рассмотрение одного типа клеток (или два, если используется система совместного культивирования), тогда как неповрежденной ткани мозга неоднородна, содержащие различные типы клеток, которые взаимодействуют друг с другом. Органотипической системы культуры ломтик (тонкие эксплантатах мозговой ткани) также используются, и эти модели позволяют изучение гетерогенных популяций клеток, поскольку они находятся в естественных условиях. Тем не менее, лишь ограниченное количество ткани можно получить от каждого животного при использовании этого метода, ломтики можетне быть культивированы так долго, как иммортализованных клеточных линий, и от среднего до долгосрочного культуры могут привести к изменениям в сигнальных путей и рецепторов в срезах. В то время как пожилые мозг может быть использован для создания органотипической ломтики, кусочки от незрелого мозга более склонны к культуре, и более широко используется. Существует, следовательно, необходимость в разработке моделей, которые имитируют или представляют нетронутыми зрелый мозг, что просты в использовании, в котором нейронные сигнальные пути могут быть рассмотрены.
При этом техника в пробирке с участием нетронутыми нервной ткани, которую можно использовать для выяснения молекулярные механизмы, участвующие в клеточной смерти после эксцитотоксического или ишемического инсульта описано. Этот метод уменьшает количество животных, необходимых для выполнения эксперимент, воспроизводим и генерирует жизнеспособной ткани, которая ведет себя в метаболически аналогично больших органотипических ломтиками. Кроме того, нейронная схема, сотовые взаимодействия, и постсинаптического соmpartment остается частично нетронутыми. Физиологическая буфер, используемый позволяет клеточные мембраны "запечатать", а также позволяет клеткам восстановить свой первоначальный сопротивление мембраны 9. Эта модель мозга срез способен добросовестно имитировать ответов наблюдаемые следующие эксайтотоксичность опосредованной травмы головного мозга 10, и может быть использован для изучения молекулярных механизмов, участвующих в ход.
Protocol
Representative Results
Discussion
При этом пробирке метод в для генерации microslices которые могут быть использованы для изучения молекулярные механизмы, вовлеченные в эксайтотоксичности и ишемии-опосредованной гибели клеток в интактной ткани головного мозга зрелого описано. Эта техника производит жизнеспособ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательских средств из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, Хантер НИИ медицинских и Университета Ньюкасла.
Materials
| Guillotine | Used to decapitate animal | ||
| Surgical equipment | Forceps, scissors, tweezers, etc, for brain removal and dissection | ||
| McIlwain chopper | Used to generate 100-400 μm brain sections. | ||
| McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella. | |||
| Round bottom plastic tubes | Greiner | ||
| Water bath | For keeping tissue at 37 °C | ||
| Aerating apparatus | Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment | ||
| Flat bottomed polystyrene tubes | Nunc | ||
| Dounce Homogenizer |
References
- Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).
- Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death. Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).
- Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage. Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).
- Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures. J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).
- Kristensen, B. W., Noraberg, J. Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).
- Lecrux, C., et al. Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions. Stroke. 38, 3007-3015 (2007).
- Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity. J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).
- Morrison, B. 3. r. d., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review. J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).
- McIlwain, H. Practical Neurochemistry. , (1975).
- Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).
- Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. 3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain. Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).
- Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain. Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).
- Sharps, E. S., McCarl, R. L. A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells. Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).
- Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis. J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).
- Rodnight, R., McIlwain, H. Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils. Biochem. J. 57, 649-661 (1954).
- Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. Microtubule assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).
