Antiretroviral tedavisi (ART) başarısız HIV-1 enfekte bireyler için ilaç direnci test gelecekteki tedaviler rehberlik ve tedavi sonuçlarını artırabilir. HIV yaygınlığının yüksek ama kaynak sınırlı ayarları optimize bireysel ve nüfus sağlık çıktıları sonuçta uygun fiyatlı ve erişilebilir ilaç direnci genotiplendirmesi ve yorumlama yöntemlerini gerektirir.
HIV-1 ilaç direnci ciddi antiretroviral tedavi (ART) etkinliğini ve etkisini uzlaşma potansiyeline sahiptir. Sahra-altı Afrika'da ART programları genişletmeye devam ederken, ART bireyler yakından ilaç direncinin ortaya çıkması için izlenmelidir. ART zaten dirençli viral suşlar izlemek için iletilen ilaç direnç sürveyansı da önemlidir. Genotiplendirme pahalı ve sofistike laboratuvar ve veri yönetimi altyapı gerektirir çünkü ne yazık ki, ilaç direnci testi, hala kaynak sınırlı ayarları kolayca erişilebilir değil. Bireyleri yönetmek ve bulaşan ilaç direncini değerlendirmek için bir açık erişim genotipik ilaç direnci izleme yöntemi tarif edilmektedir. Yöntem ilaç direnci desen yorumlanması ve bireysel hasta raporlarının nesil için ücretsiz açık kaynak yazılımı kullanır. Genotipleme protokol av plazma örnekleri için% 95'den daha büyük bir büyütme oranına sahiptiriral yük> 1000 HIV-1 RNA kopya / ml. Duyarlılığı viral yükleri <1.000 HIV-1 RNA kopya / ml için önemli ölçüde azaltır. Burada anlatılan yöntem olup, Birleşik Devletler Gıda ve İlaç İdaresi (FDA), Viroseq genotipleme yöntemi ile onaylı bir test HIV-1 ilaç direnci için bir yönteme göre doğrulanmıştır. Burada tarif edilen yöntemin sınırlamalar bu otomatik ve aynı panelinden alt tipleri A ve B, aynı zamanda ne kadar büyütülmüş, numune bir doğrulama panelinden dolaşan bir şekilde yeniden birleştirici CRF02_AG amplifiye etmek için başarısız olmadığı gerçeğini içerir.
Güney Afrika'da HIV salgını, özellikle Güney Afrika 2, 3, antiretroviral tedavi (ART) bireylere eşlik eden bir üstel artış ile hızla 1 gelişen olmuştur. Insidansını 4 azaltılması ve kaynak sınırlı ayarları yaşam beklentisini (HBS) 5. artan büyük ölçekli tedavi programlarının epidemiyolojik etkisi üzerine delil olarak toplanmaya devam eder, ART kapsamını artırmak için çalışmalar hızlandırılacaktır. Test ve tedavi programları altında bir önleme aracı 6, 7 gibi tedavi kullanımına yönelik kılavuzların evrimi tedavi bireylerin mutlak sayısı daha da artacak demektir. Çok sayıda insanın ART bireylerin ortalama yaşam beklentisi, HIV enfekte olmayan nüfusun 8 o yaklaştıkça daha uzun süre için ART olacak. HIV ilaç direnci gelişimi ve iletim alwa varYS ART 9-12 başarılarına bir tehdit olarak kabul edilmiştir. Bu nedenle, daha fazla birey SANAT üzerine başlatılmaktadır daha fazla sıkı gözetim ve ilaç direncinin görüntülenmesi için bir ihtiyaç vardır.
Genotipik ilaç direnci (GRT) test gözetim için hem de ART alan bireylerde HIV-1 ilaç direncinin izlenmesi, hem gelişmiş ülkelerde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. Bu ayarları, GRT HIV-1 enfekte bireyler için bakım sürekliliği entegre edilmiştir. Çoğu uluslararası kurallar yetişkin ya da ART (birinci basamak ve ikinci basamak) 13-15 başarısız pediatrik hastalar için GRT tavsiye, pediatrik anneden çocuğa bulaşmasının (PMTCT) rejimleri önlenmesi maruz kalan hastalar ancak daha sonra 16 enfekte ile ayarları akut olarak enfekte olmuş bireylerin 13-15 arasında iletilen ilaç direnci yüksek seviyeleri. Ancak, maliyet, teknoloji ve altyapı gereksinimleri implemen sınırlıHBS ilaç direnci izleme benzer yaklaşımların tation.
Güney Afrika HIV tedavisi ve izlenmesi kurallar halen birinci basamak 17 rejimleri başarısız bireyler için ART rehberlik seçiminde GRT kullanımını tavsiye etmiyoruz. Bireyler öncelikle virolojik (HIV-1 RNA viral yük) parametreleri esas açılır. Ancak 2012 yılında, Güney Afrika, HIV Klinisyenler Derneği ilk Güney Afrikalı ARV ilaç direnci test yönergeleri 18 yayınladı. Bu kurallar ilk satır ve ikinci satır ART başarısız tüm yetişkinler için ve PMTCT 18 maruz enfekte bebekler ve çocuklar için GRT testini öneririz. Güney Afrika 19-29 iletilen ilaç direnci yüksek düzeyde için hiçbir geçerli kanıt yoktur Ancak, GRT akut enfekte bireyler için 18 tavsiye edilmez. Bu önerilerin bazıları ulusal tre içine zamanla entegre olacağı bekleniyorBölgedeki çeşitli ülkelerin nuları ailenizle konuşmak ve izleme kuralları. Zaten, 2013 Güney Afrika tedavi kılavuzlarında yetişkinler için ikinci bir hat arızası sırasında ve çocuklar 30 için birinci veya ikinci basamak PI-temelli rejim başarısızlık zamanında GRT önerisi şimdi var.
Güney Afrika'da tedavi kılavuzlarının içine GRT birleştiren potansiyel olarak maliyet-nötr olacağı gösterilmiştir. Gerçekten ikinci basamak tedavisi için açık olması gereken hastaları belirlemek için GRT kullanarak, görece daha pahalı ilk basamak ilaçlar daha vardır ikinci çizgi rejimi ilaçların maliyeti göz önüne alındığında programı herhangi bir ek maliyet neden olmayacaktır. Buna ek olarak, GRT da, başarısızlığın diğer nedenleri belirlemek tedavi seçenekleri korumak ve ortaya çıkan direnç desenleri 31 hakkında bilgi üretebilir. Bu nedenle, daha da bağlantısı, bakım An kalitesini artırmak için ilaç direnci izleme yöntemlerinin maliyetini azaltmak için gerekli oland sonuçları.
Burada, ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve sıralama (Tablo 1), hem de ilaç direnci yorumlanması için çoğunlukla açık kaynak yazılımlar için genel (açık kaynak) primerler kullanmak üzere tasarlanmış bir GRT yöntem mevcut. Klinik yönetimi için, protokol, ulusal tedavi kılavuzlarının yakın bağlılık ile laboratuvar ilaç direnci raporun uzman yorumuyla kapsamlı bir inceleme ve raporlama yöntemiyle tarafından iltifat. Protokol, dört farklı bileşenler ayrılır: 1) HIV ribonükleik asit (RNA) ekstraksiyon, 2) Ters transkripsiyon ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu, viral hedefler, 3) Sıralama ve kromatogramlar, hizalama analizi için 4) Biyoinformatik yöntemleri, curation ve dizi verilerinin yorumlanması.
Birçok düşük maliyetli içi yöntemler 33, 34, 36 HIV ilaç direnci genotiplendirme daha uygun hale getirmek için denemek için çabalarında tarif edilmiştir. Kaynak sınırlı ayarları antiretroviral tedavinin bireyler için bakım süreklilik haline ilaç direnci test entegre etmek gerek hiç şüphe yoktur. Ancak, bildirilen yöntemler çoğu toplum düzeyinde ilaç direncinin gözetiminde ilaç direnci genotiplemede uygulama odaklanmak. Satürn / Life Technologies genotiplendirme yöntemi gözetim ve ilaç direncinin izlenmesi için tam entegre bir protokoldür. Bu yöntem, klinik yönetimi için raporlar ilaç direnci ve neslin yorumlanması için çoğunlukla açık kaynak ve açık erişim biyoinformatik kaynaklarını uygulanması uygun bir protokol olarak tasarlanmıştır.
Bu olmak için FDA onaylı Viroseq genotipleme yöntemi ile karşılaştırılarak gösterildibaşarılı bir şekilde çoğaltıldı laboratuvar Paneldeki çoğaltılan kütüphane numunelerinin% 100 ANRS test örneklerinin bir panel, ikinci ilaç direnci başkalaşımların teşhis doğru. Doğruluğu da alt C virüsleri, Güney Afrika'nın en baskın alt tipinin klinik örneklerinde değerlendirildi. Yöntem CRF02_AG yaygın olduğu dünyanın diğer bölgelerinde kullanılacak ise yöntem Ancak alt tip A ve B ile ilgili olarak alt C numuneleri üzerinde kadar doğru olduğu, yöntemi bu yana primerlerin modifikasyonu için bir ihtiyaç vardır CRF02_AG sahip olduğu gösterilmiş olan panel örneklerinden biri yükseltmek için başarısız oldu. Alt dağıtım 38 daha heterojen olduğu Alternatif M 33 virüs tüm grup duyarlı primerler bir dejenere dizi, 36 bölgelerde kullanılabilir.
Ters transkripsiyon ve PCR duyarlılığı, örneğin 500 ml olarak plazma daha yüksek miktarlar, RNA ekstre artırılabilir. Plazma Santrifüj edilebilirQIAamp viral RNA ekstraksiyonu, mini kiti ile tarif edildiği gibi protokol ile devam etmeden önce, viral parçacıklar konsantre 90 dakika boyunca 21,000 xg'de uged.
Gösterildiği gibi, yeni yöntem, bireysel hasta yönetimi için kapsamlı raporları üretir ek bir avantaja sahiptir. Bu raporlar RegaDB gelen genotip bir konsolidasyon, immünolojik ve virolojik izleme verilerinin yanı sıra, klinik ve tedavi öyküsü vardır. Bu aynı derecede ayrıntılı bir hastanın klinik geçmişi gözden yanı sıra tedavi önerileri takip direnç profilinin ayrıntılı laboratuar yorumuyla eşlik ediyor. Raporlarını incelemek ve hastalar için tedavi önerileri sağlamak için bir uzman hekimlerin kullanımı, hemşire gibi giderek değişen görev için DSÖ önerileri parçası olarak Güney Afrika'da ART sağlayan deneyimsiz klinisyenler için çok ihtiyaç duyulan mentorluk sağlar. Bu klinikraporlar ilaç direnci yönetiminde az veya hiç deneyimi olan klinisyenler için etkili öğretim yardımcıları olduğu gösterilmiştir. Hasta açısından bakıldığında, bizim yöntemimiz uzman HIV hizmetlerine erişmek için merkezi sitelere seyahat ihtiyacını azaltır.
Böylece, bir bütün olarak ele alındığında açıklanan protokol HIV ilaç direnci yönetimi HIV ile enfekte kişilerde başarısız ART için bakım süreklilik haline, uygun bir maliyetle entegre edilebildiği iyi bir platform sağlar. Üretilen veriler eden ilaç direnci gelişimi ve iletim değerlendirmek için epidemiyolojik amaçlar için kullanılabilir. Oluşturulan pol fragmanın büyüklüğü nüfus düzeyinde salgın daha iyi anlaşılmasını üretecek daha karmaşık filogenetik analiz için yeterince iyidir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar bu işi mümkün yapılan tüm meslektaşlarını, özellikle Maya Balamane, Elizabeth Johnston Beyaz, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty kabul etmek istiyorum , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott ve Lungani Ndwandwe. Yazarlar ayrıca, Sağlık Bakanlığı ve Hlabisa HIV Tedavi ve Bakım Programı çalışmak Afrika Merkezi personelin tüm personele teşekkür etmek istiyorum.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |