tests de résistance des médicaments pour le VIH-1 individus infectés échec d'un traitement antirétroviral (ART) peut guider les futurs traitements et d'améliorer les résultats du traitement. Optimisation des individus et des populations résultats pour la santé de la prévalence élevée du VIH, mais les pays à ressources limitées finira par exiger le génotypage de la résistance aux médicaments abordables et accessibles et méthodes d'interprétation.
VIH-1 de la pharmacorésistance a le potentiel de compromettre sérieusement l'efficacité et l'impact de la thérapie antirétrovirale (ART). Comme les programmes de traitement antirétroviral en Afrique sub-saharienne continuent à se développer, les personnes sous ARV doivent être étroitement surveillés pour l'émergence de la résistance aux médicaments. La surveillance de la résistance aux médicaments transmis pour suivre la transmission de souches virales déjà résistantes à l'ART est également critique. Malheureusement, les tests de résistance aux médicaments n'est pas encore facilement accessibles en situation de ressources limitées, car le génotypage est coûteux et nécessite laboratoire sophistiqué et l'infrastructure de gestion des données. Une méthode génotypique d'accès ouvert de surveillance de la résistance aux médicaments de gérer des individus et évaluer la résistance aux médicaments transmis est décrite. La méthode utilise un logiciel libre et open source pour l'interprétation des profils de résistance aux médicaments et la génération de rapports individuels des patients. Le protocole de génotypage a un taux d'amplification supérieur à 95% pour les échantillons de plasma avec avcharge IRAL> 1000 VIH-1 copies d'ARN / ml. La sensibilité diminue de manière significative pour les charges virales <copies 1000 ARN VIH-1 / ml. La méthode décrite ici a été validé contre une méthode de VIH-1 de la pharmacorésistance tests approuvés par la Food and Drug Administration (FDA), la méthode de génotypage ViroSeq. Limites de la méthode décrite ici comprennent le fait qu'il n'est pas automatique et qu'elle a également échoué pour amplifier la forme circulante recombinante CRF02_AG partir d'un panneau de validation d'échantillons, bien qu'il amplifie les sous-types A et B d'un même panneau.
L'épidémie de VIH en Afrique australe a connu une évolution rapide 1 avec une augmentation exponentielle concomitante chez les personnes sous traitement antirétroviral (ART), en particulier en Afrique du Sud 2, 3. Comme preuve de l'impact épidémiologique des programmes de traitement à grande échelle pour réduire l'incidence 4 et l'augmentation de l'espérance de vie dans les pays à ressources limitées (RLS) 5 continue à s'accumuler, les efforts visant à accroître la couverture du traitement antirétroviral seront intensifiés. L'évolution des lignes directrices à l'utilisation du traitement comme outil de prévention 6, 7 au titre des programmes de test et traitement signifie que le nombre absolu de personnes sous traitement va encore augmenter. Un grand nombre de personnes seront sous ARV pendant de longues périodes de temps que l'espérance de vie moyenne des individus sur ART se rapproche de celui de la population non infectée du VIH 8. Le développement et la transmission de la pharmacorésistance du VIH a Always été considéré comme une menace pour les réalisations de l'art 9-12. Ainsi, il est nécessaire pour la surveillance et le suivi de la résistance aux médicaments plus rigoureux que plusieurs personnes sont engagées sur ART.
Tester la résistance aux médicaments génotypique (GRT) a été utilisé avec succès dans les pays développés, à la fois pour la surveillance ainsi que la surveillance du VIH-1 la résistance aux médicaments chez les personnes recevant un traitement antirétroviral. Dans ces contextes, GRT a été intégrée dans le continuum de soins pour le VIH-1 individus infectés. La plupart des directives internationales recommandent TJB pour les patients adultes ou pédiatriques défaut ART (première ligne et de deuxième ligne) 13-15, les patients de pédiatrie exposés à la prévention de la transmission mère-enfant (PTME), mais par la suite les régimes infectés 16, et dans les endroits où hauts niveaux de résistance aux médicaments transmis entre les individus présentant une infection aiguë 13-15. Toutefois, les exigences de coûts, de la technologie et de l'infrastructure ont limité la miseœuvre des approches similaires à la surveillance de la résistance aux médicaments dans le SJSR.
Le traitement du VIH d'Afrique du Sud et des lignes directrices de suivi ne recommande pas actuellement l'utilisation de GRT dans le choix de guidage de l'ART pour les personnes défaillantes schémas de première intention 17. Les individus sont mis basée principalement sur virologique (ARN VIH-1 charge virale) paramètres. Cependant en 2012, l'Afrique australe cliniciens du VIH Société a publié les premières lignes directrices 18 tests de résistance aux médicaments ARV Afrique du Sud. Ces lignes directrices recommandent de tester GRT pour tous les adultes à défaut de première ligne et de deuxième intention et pour les nourrissons infectés et les enfants exposés à la PTME 18. Cependant, GRT n'est pas recommandé pour les personnes de 18 infection aiguë, car il n'existe aucune preuve réelle des niveaux élevés de résistance aux médicaments transmis dans le sud de l'Afrique 19-29. Il est prévu que certaines de ces recommandations seront intégrés au fil du temps dans le tre nationalatment et suivi les directives des différents pays de la région. Déjà, en 2013 des lignes directrices de traitement en Afrique du Sud il ya maintenant recommandation du GRT au moment de l'échec de deuxième ligne pour les adultes et au moment de la première ou de deuxième ligne échec thérapeutique à base d'IP pour les enfants 30.
Il a été démontré que l'incorporation de GRT dans les directives de traitement en Afrique du Sud serait potentiellement coût-neutre. Compte tenu du coût des médicaments de deuxième ligne de traitement qui sont relativement plus chers que les médicaments de première ligne, en utilisant GRT pour identifier les patients qui ont vraiment besoin d'être passé à un traitement de deuxième ligne n'entraînera pas de coût supplémentaire pour le programme. En outre, GRT peut également identifier d'autres raisons de l'échec, de conserver les options de traitement et de générer des informations sur les profils de résistance émergents 31. Par conséquent, il est nécessaire de réduire le coût des méthodes de surveillance de la résistance aux médicaments encore plus loin afin d'améliorer l'accès, la qualité des soins d'und résultats.
Ici, nous présentons une méthode de GRT conçu pour utiliser génériques (open source) des amorces pour la transcription inverse, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage (tableau 1), ainsi que les logiciels open source pour la plupart de la pharmacorésistance interprétation. Pour la gestion clinique, le protocole est complété par un examen et un signalement méthode complète avec interprétation spécialiste du rapport de la résistance aux médicaments de laboratoire avec un strict respect des directives nationales de traitement. Le protocole est divisé en quatre composantes différentes: 1) acide ribonucléique du VIH (ARN) de l'extraction, 2) la transcription inverse et Polymerase Chain Reaction (PCR) de cibles virales, 3) séquençage et 4) les méthodes de bio-informatique pour l'analyse des chromatogrammes, alignement, curation et l'interprétation des données de séquence.
Plusieurs faible coût des méthodes internes ont été décrits dans les efforts pour tenter de faire génotypage de la pharmacorésistance du VIH plus abordables 33, 34, 36. Il ne fait aucun doute de la nécessité d'intégrer les tests de résistance aux médicaments dans le continuum de soins pour les personnes sous traitement antirétroviral dans les pays à ressources limitées. Cependant, la plupart des méthodes déclarés se concentrent sur l'application de génotypage de la pharmacorésistance dans la surveillance de la résistance aux médicaments au niveau de la population. La méthode de génotypage Saturne / Life Technologies est un protocole entièrement intégrée pour la surveillance et le suivi de la résistance aux médicaments. Cette méthode a été conçue pour être un protocole abordable mise en œuvre de la plupart open source et open ressources accès bioinformatiques pour l'interprétation de la résistance aux médicaments et la production de rapports de gestion clinique.
Il a été démontré par la comparaison avec la méthode de génotypage ViroSeq approuvé par la FDA pour êtreprécis dans l'identification des mutations de résistance aux médicaments à partir d'un panel de l'ANRS échantillons d'essais d'aptitude, dans 100% des échantillons de panneaux de laboratoire qui ont été amplifiés avec succès. La précision a également été évaluée sur des échantillons cliniques de virus de sous-type C, le sous-type le plus dominant en Afrique australe. Le procédé était le plus précis sur des échantillons de sous-type C tel qu'il était sur le sous-type A et B. Cependant, si le procédé sera utilisé dans d'autres parties du monde où CRF02_AG est répandue, il existe un besoin pour la modification des amorces puisque le procédé pas amplifier un des échantillons du panel qui a été montré pour avoir CRF02_AG. En variante, un ensemble d'amorces sensibles à tous les virus du groupe M 33 dégénérée, 36 pourrait être utilisé dans les régions où le sous-type de la distribution est plus hétérogène 38.
La sensibilité de la transcription inverse et la PCR peut être augmentée par l'extraction de l'ARN à partir de l'augmentation des volumes de plasma, telles que 500 ml. Le plasma peut être centrifuged à 21 000 g pendant 90 min à concentrer les particules virales avant de poursuivre avec le protocole tel que décrit par le mini kit d'extraction d'ARN viral QIAamp.
Comme indiqué, la nouvelle méthode présente un avantage supplémentaire qu'il produit des rapports complets pour la gestion individuelle du patient. Ces rapports sont une consolidation du génotype, immunologiques et des données de surveillance virologique ainsi que l'histoire clinique et le traitement de RegaDB. Ceci est accompagné par une interprétation de laboratoire détaillée du profil de résistance suivie par un examen aussi détaillé de l'histoire clinique du patient ainsi que des recommandations de traitement. L'utilisation d'un spécialiste médecins d'examiner les rapports et faire des recommandations de traitement pour les patients fournit le mentorat bien nécessaire pour les infirmières praticiennes ainsi que des cliniciens expérimentés, qui sont de plus en plus offrent ART en Afrique du Sud dans le cadre des recommandations de l'OMS pour la délégation des tâches. Ces cliniquerapports ont été montrés comme des aides d'enseignement efficaces pour les cliniciens ayant peu ou pas d'expérience dans la gestion de la résistance aux médicaments. Du point de vue du patient, notre méthode réduit le besoin de se déplacer vers des sites centralisés pour accéder à des services spécialisés pour le VIH.
Ainsi, le protocole décrit dans son ensemble constitue une bonne plate-forme à travers laquelle la gestion de la résistance du VIH aux médicaments peut être intégré, à un coût abordable, dans le continuum de soins pour les personnes infectées par le VIH ART défaut. Les données générées peuvent être utilisés à des fins épidémiologiques pour évaluer l'évolution et la transmission de la résistance aux médicaments dans la communauté. La taille du fragment pol généré est assez bon pour l'analyse phylogénétique plus complexe qui va produire une meilleure compréhension de l'épidémie au niveau de la population.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier tous les collègues qui ont rendu ce travail possible, en particulier Maya Balamane, Elizabeth Johnston Blanc, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott, et Lungani Ndwandwe. Les auteurs tiennent aussi à remercier tout le personnel du ministère de la Santé et le personnel du Centre Afrique qui travaillent le traitement du VIH Hlabisa et programme de soins.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |