Тестирование Лекарственная устойчивость ВИЧ-1-инфицированных лиц неудовлетворительную антиретровирусную терапию (АРТ) может служить ориентиром для будущих терапий и улучшить результаты лечения. Оптимизация частных лиц и населения последствия для здоровья в высокой распространенностью ВИЧ, но с ограниченными ресурсами в конечном итоге потребует недорогих и доступных генотипирование лекарственной устойчивости и методы интерпретации.
ВИЧ-1 лекарственная устойчивость имеет потенциал, чтобы создать серьезную угрозу эффективность и результативность антиретровирусной терапии (АРТ). Как ART программы в странах Африки южнее Сахары продолжают расширяться, лица АРТ следует внимательно следить за появлением лекарственной устойчивости. Наблюдение передаваемой лекарственной устойчивости, чтобы отслеживать передачу вирусных штаммов уже устойчивых к АРТ также имеет важное значение. К сожалению, тестирование лекарственной устойчивости до сих пор не легко доступны в условиях ограниченных ресурсов, потому что генотипирование дорого и требует сложного лабораторного и инфраструктуры управления данными. Открытый доступ генотипическая метод мониторинга лекарственной устойчивости управлять лиц и оценить переданную лекарственной устойчивости описывается. Метод использует свободное программное обеспечение с открытым исходным кодом для интерпретации резистентности наркотиков и генерации отдельных отчетов пациентов. Протокол генотипирование имеет уровень усиления более 95% для образцов плазмы с AVИРАЛ нагрузка> 1000 РНК ВИЧ-1 копий / мл. Чувствительность значительно уменьшается за вирусной нагрузкой <1,000 РНК ВИЧ-1 копий / мл. Описанный здесь метод был проверен на метод ВИЧ-1 лекарственной устойчивости тестирование утвержденной США продовольствия и медикаментов (FDA), методом ViroSeq генотипирования. Ограничения по способу, описанному здесь, включают тот факт, что он не автоматизированный и что он также не усиливать циркулирующей рекомбинантной форме CRF02_AG с пульта проверки образцов, хотя это усиливается подтипы А и В из той же панели.
Эпидемия ВИЧ в Южной Африке стремительно 1 развивается с сопутствующей экспоненциальному увеличению лиц по антиретровирусной терапии (АРТ), особенно в Южной Африке 2, 3. В качестве доказательства на эпидемиологического воздействия программ крупномасштабных лечения в снижении заболеваемости 4 и увеличения средней продолжительности жизни в странах с ограниченными ресурсами (RLS) 5 продолжает накапливаться, усилия по увеличению охвата АРТ будет усиливаться. Эволюция принципов к использованию лечения как профилактики инструмента 6, 7 под испытать и обработать программ означает, что абсолютное число лиц, получающих лечение приведет к дальнейшему увеличению. Большое количество лиц будет на АРТ в течение более длительных периодов времени, как средняя продолжительность жизни особей, получающих АРТ приближается, что из неинфицированных населения ВИЧ 8. Разработка и передача лекарственной устойчивости ВИЧ имеет ALWAYS были рассматриваться как угроза достижений АРТ 9-12. Таким образом, существует потребность в более строгой наблюдения и контроля за лекарственной устойчивости как все больше людей инициируются на АРТ.
Тестирования Генотипическая лекарственная устойчивость (ОТО) успешно используется в развитых странах, как для наблюдения, а также мониторинг ВИЧ-1 лекарственной устойчивости у лиц, получающих АРТ. В этих условиях, GRT была интегрирована в продолжающегося ухода за ВИЧ-1-инфицированных лиц. Большинство международных руководящие принципы рекомендуют ОТО для взрослых или детей больные не АРТ (первой линии и второй линии) 13-15, педиатрических больных подвергаются профилактики передачи ВИЧ от матери ребенку (ПМР) схемами, но впоследствии заражены 16, и в ситуациях, когда высокие уровни передаваемой лекарственной устойчивости среди остро инфицированных 13-15. Тем не менее, стоимость, технологии и инфраструктуры требования ограничили внедретации подобных подходов к мониторингу лекарственной устойчивости RLS.
Лечение ЮАР ВИЧ и руководящие принципы мониторинга в настоящее время не рекомендуется использовать ОТО в руководящей выбора АРТ для лиц противном случае схемы первой линии 17. Лица включаются базируется прежде всего на вирусологических (РНК ВИЧ-1 вирусной нагрузки) параметров. Однако в 2012 году, юга Африки Общество ВИЧ Клиницисты опубликовал первые южные руководящие принципы Африканского АРВ тестирования лекарственной устойчивости 18. Эти руководящие принципы рекомендуют тестирование GRT для всех взрослых противном случае первой линии и второй линии АРТ и для ВИЧ-инфицированных детей и детей, подвергшихся воздействию ППМР 18. Тем не менее, GRT не рекомендуется 18 для остро инфицированных, потому что в настоящее время нет доказательств для высоких уровней передаваемой лекарственной устойчивости в южной части Африки 19-29. Ожидается, что некоторые из этих рекомендаций будут интегрированы со временем в национальную третерпимостью и лечением и мониторинга руководящие принципы различных стран региона. Уже в южноафриканских принципов лечения 2013 в настоящее время рекомендация ОТО при возникновении неисправности второй линии для взрослых и во время первой или второй линии ПИ на основе отказа режим для детей 30.
Было показано, что включение ОТО в лечебных принципов в Южной Африке будет потенциально экономически нейтральным. Учитывая стоимость второго режима линия препаратов, которые относительно дороже, чем препараты первого ряда, с помощью ОТО для выявления пациентов, которые действительно должны быть переключен на второй линии терапии не приведет дополнительных затрат на программу. Кроме того, GRT может также определить и другие причины для отказа, сохранить варианты лечения и генерировать информацию о новых резистентности 31. Таким образом, необходимо снизить стоимость методов мониторинга лекарственной устойчивости еще дальше в целях улучшения доступа, качество ухода за апрезультаты. D
Здесь мы представляем метод GRT, предназначенный для использования универсальных (Open Source) праймеров для обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования (табл. 1), а также в основном с открытым исходным кодом программного обеспечения для интерпретации лекарственной устойчивости. Для клинического ведения, протокол дополняется комплексного метода обзора и отчетности с специалиста интерпретации отчета лаборатории лекарственной устойчивости с непосредственной соблюдения национальных руководящих принципов лечения. Протокол состоит из четырех различных компонентов: 1) ВИЧ рибонуклеиновой кислоты (РНК) добыча, 2) обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификации вирусных мишеней, 3) Секвенирование и 4) методы биоинформатики для анализа хроматограмм, выравнивание курирование и интерпретация данных последовательностей.
Несколько бюджетные в доме методы были описаны в усилиях попробовать сделать лекарственная устойчивость генотипирование ВИЧ более доступными 33, 34, 36. Существует никаких сомнений в необходимости интеграции тестирование лекарственной устойчивости в постоянной помощи для физических лиц на антиретровирусной терапии в условиях ограниченных ресурсов. Тем не менее, большинство зарегистрированных методов сосредоточиться на применении лекарственной устойчивости генотипирования в надзора за лекарственной устойчивостью на уровне населения. Метод генотипирования Сатурн / Life Technologies представляет собой полностью интегрированное протокол для наблюдения и контроля за лекарственной устойчивости. Этот метод был разработан, чтобы быть доступным протокол реализации в основном открытым исходным кодом и открытых биоинформатики доступ к ресурсам для интерпретации лекарственной устойчивости и генерации отчетов для клинического ведения.
Было показано, путем сравнения с FDA утвержденных ViroSeq метода генотипирования, чтобы бытьточны в идентификации мутаций лекарственной устойчивости из панели ANRS образцов профессионального тестирования, в 100% проб панели лабораторных, которые были успешно усиливаются. Точность также оценивали по клиническим образцов подтипа C вирусов, самых доминирующих подтипа в южной части Африки. Метод был точным на подтипа образцов С, как это было на подтипа А и В. Однако, если метод будет использоваться в других частях мира, где преобладает CRF02_AG, существует необходимость для модификации праймеров, так как метод не смогли усилить один из образцов панелей, что было показано, что CRF02_AG. Кроме того, вырожденный набор праймеров чувствительных всей группе М вирусов 33, 36 могут быть использованы в регионах, где распределение подтип более разнородной 38.
Чувствительность обратной транскрипции и ПЦР может быть увеличена путем экстракции РНК из более высоких объемов плазмы, таких как 500 мл. Плазма может быть центрифугированияuged на 21000 мкг в течение 90 мин, чтобы сконцентрироваться вирусные частицы прежде чем приступить к протоколу, как описано вирусной экстракции РНК мини комплект QIAamp.
Как показано, новый метод имеет дополнительное преимущество, что она производит комплексные отчеты для индивидуального лечения пациента. Эти отчеты являются консолидация генотипа, иммунологические и вирусологические данные мониторинга, а также клинические и лечение история от RegaDB. Это сопровождается подробным лабораторного интерпретации профиля сопротивления с последующим столь же подробного обзора истории болезни пациента, а также рекомендации по лечению. Использование врачей-специалистов для рассмотрения докладов и обеспечить рекомендации по лечению пациентов обеспечивает столь необходимую наставничества для практикующих медсестер, а также неопытных врачей, которые все чаще, предоставляющих АРТ в Южной Африке в рамках рекомендаций ВОЗ по пере-дачу. Эти клиническиедоклады были показано, что эффективные учебные пособия для врачей с небольшим опытом или вообще в управлении лекарственной устойчивости. С точки зрения пациента, наш метод снижает необходимость поехать в централизованных сайтов для доступа услуги специалистов ВИЧ.
Таким образом, описанный протокол взятое в целом предоставляет хорошую платформу, через которую управление лекарственная устойчивость ВИЧ могут быть интегрированы, по доступной цене, в продолжающегося ухода за ВИЧ-инфицированных лиц неисправного АРТ. Данные, полученные могут быть использованы для эпидемиологических целей оценить эволюцию и передачу лекарственной устойчивости в обществе. Размер POL фрагмента генерируемого является достаточно хорошим для более сложных филогенетического анализа, который будет производить лучшее понимание эпидемии на уровне населения.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность всем коллегам, которые сделали эту работу возможной, особенно Майя Balamane, Элизабет Джонстон белый, Шэрон Sjöblom, Грег Ординг Zakhona Гумеде, Xolile Kineri, Phindile Мабасо, Lungisa Ndwandwe, Джеймс Гарви, Гэвин Кобб, Senzo Maphanga, Terusha Chetty , Kevi Найду, Андрей Skingsley, Кэтрин Стотт и Lungani Ndwandwe. Авторы также хотели бы поблагодарить весь персонал Департамента здравоохранения и персонала Африка центр, которые работают на Хлабисе лечению ВИЧ и Программы по уходу.
Superscript III 1st strand Synthesis kit | Life Technologies | 18080051 | Reverse Transcription |
SATURN/LiFE Technologies Custom Primers | Life Technologies | 4473517 | PCR |
Platinum Taq | Life Technologies | 10966026 | PCR |
PureLink QUICK PCR Purification Kit | Life Technologies | K310002 | PCR |
Viroseq | ABBOTT | 4J94-20 | Reverse Transcription and PCR |
Agarose Tablets (Dnase/Rnase free) | BIOLINE | BIO-41027 | PCR |
TBE Buffer | MERCK | 1.06177.2500 | PCR |
O'Range Ruler 200bp DNA Ladder | Fermentas | FE SM0633 | PCR |
Novel Juice | GeneDireX | LD001-1000 | PCR |
MiniBis Bioimaging System | DNR Bioimaging Systems Ltd | Gel Documentation | |
Power Pac 300 | BIORAD | Gel Electrophoresis | |
Big Dye Terminator Kit ver 3.1 | Life Technologies | 4337456 | Sequencing |
Arrays | Life Technolgies | 4319899 | Sequencing |
PoP | Life technologies | 4363785 | Sequencing |
10 x EDTA Buffer | Life Technologies | 402824 | Sequencing |
Formamide | Life Technologies | 4311320 | Sequencing |
5 x Sequencing Buffer | Life Tecgnologies | 4336697 | Sequencing |
3130 xl Genetic Analyzer | Life Technologies | Sequencing | |
GeneAmp PCR System 9700 | Life Technologies | RT/PCR/Sequencing | |
Centrifuge 5804 | EPPENDORF | Sample Processing | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RNA Extraction | |
Centrifuge 5415R | EPPENDORF | RT and PCR | |
Centrifuge 5415D | EPPENDORF | PCR Product Clean up | |
Centrifuge 5810 | EPPENDORF | Sequencing Clean up | |
Picofuge | BIORAD | C1301-230V | RT and PCR |
Vortex Genius 3 | IKA | RNA Extraction | |
Vortex Genius 3 | IKA | reagent preparation | |
Vortex mixer | IKA | Sequencing Clean up | |
NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer | ThermoScientific | DNA quantification | |
3M Sodium Acetate | MERCK | 567422 | Sequencing Clean up |
Absolute Ethanol | MERCK | SAAR2233540LP | Sequencing Clean up |
1.5ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.692.005 | RNA Extraction |
2ml SARSTEDT Tubes | BIODEX | 72.693.005 | RNA Extraction |
2ml Collection tubes | SCIENTIFIC GROUP | MCT-200-NC/S | RNA Extraction |
Optical MicroAmp 96 Well reaction plates | Life Technologies | N8010560 | Sequencing |
200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps | STAR Lab – supplied by CELTIC | A1402-3700 | RT and PCR |
200ul PCR individual tubes | Scientific Group | CR/3745 | RT and PCR |
Geneious | Biomatters | Sequence analysis | |
Internet Access | Preferrably high speed | ||
Web resources | |||
hivdb.stanford.edu | Stanford University | Drug reistance analysis | |
http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB | SATuRN | database | |
http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html | SATuRN | Sequence quality tool |