Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo
Summary
Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.
Abstract
SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.
Introduction
Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral 1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de 2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación eucariota 2 α). SG son estructuras dinámicas que intercambian los componentes con los polisomas y otros gránulos como los P-cuerpos. Constituyen un "centro de triage", donde los ARNm se clasifican y procesan, ya sea para la traducción, el reinicio, la degradación o el paquete en mRNPs no polysomal estables 3. El conjunto de SGS es rápido but es un proceso gradual con numerosos pequeños agregados iniciales, que se unen en gránulos más grandes. El uso de inhibidores químicos que interrumpen o estabilizar los microtúbulos muestra que se requiere la red de microtúbulos para la dinámica de SG incluyendo los procesos de montaje, coalescencia y desmontaje.
El ensamblado dinámico de SGS también es promovida por la agregación de proteínas de unión de ARN-específicos (ARN-BP) como TIA-1 (de células T antígeno interna-1) y TIAR (proteína relacionada con el TIA-1), que son capaces de dimerizar y promover polysome desmontaje y el encaminamiento de los ARNm en SGS 4. G3BP (proteína de unión a dominio SH3 de RasGAP) es una ARN-BP tales que localiza a SGS cuando las células están estresados con arsenito o alta temperatura, y la sobreexpresión de G3BP desfosforilado pueden inducir conjunto de SG 5.
G3BP es un conservadas evolutivamente ARN-BP que se caracterizó inicialmente a través de su interacción con una proteína activadora de GTPasa Ras-(p RasGAP120 6); pero esta interacción ha sido recientemente revisada 7. La familia G3BP incluye dos miembros en los mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) y G3BP2 8. Ambas proteínas colocalize en SG, cuando las células son sometidas a estrés 9. G3BPs comprenden un dominio N-terminal NTF2 sugerido para influir en su localización y oligomerización, seguido de prolina ricos (PxxP) los motivos, a continuación, los motivos C-terminales asociados con RNA vinculante: la canónica ARN-Reconocimiento Motif (RRM) con RNP1 y RNP2 motivos conservados , seguido de una rica cuadro de arginina-glicina (RGG). Curiosamente, el análisis de diferentes partes de la proteína mediante la construcción de diferentes dominios fusionados a EGFP mostró que el dominio NTF2-y el dominio de unión al ARN fueron la reclutó más eficiente a SGS, lo que sugiere la importancia de las propiedades de la dimerización y de unión al ARN en la asamblea de SGS. Diversos modelos han revelado diferentes funciones de las proteínas G3BP in vitro 10-13.La interrupción de la G3BP en ratones han demostrado la importancia de esta proteína en el desarrollo del crecimiento y la supervivencia 14, así como un papel importante para G3BP en el Sistema Nervioso Central (SNC), caracterizado por ataxia y defectos en memoria de trabajo espacial 15. Deficiencia G3BP conduce a la alteración neuronal plasticidad y calcio homeostasis, estableciendo un vínculo directo entre la formación de SG y enfermedades neurodegenerativas 15. Es por lo tanto importante ser capaz de estudiar la dinámica de SG en células primarias como las neuronas.
Este protocolo proporciona una manera simple de observar el conjunto de contener G3BP1-SG en células primarias bajo tratamiento arsenito. Se puede utilizar para estudiar el montaje SG bajo diferentes condiciones, por ejemplo, diferentes tipos de tensiones. También se puede adaptar a otros gránulos u otros constituyentes de SGS. De hecho, este protocolo se centra en G3BP1, pero hay otros marcadores de gránulos de estrés como TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (proteína X Frágil Retraso Mental Síndrome) 16, (proteína de unión a DNA respuesta transactivo 43) TDP-43 17 o Staufen 18. En particular, las proteínas como TIA-1 / R son, como G3BP, nucleación proteínas de unión de ARN que pueden inducir conjunto de SG cuando se sobreexpresa, incluso si los diferentes SG formados pueden diferir en función, regulación y transcripciones asociadas. La transfección de versión fluoróforo de etiquetado de cualquiera de estos componentes clave o nucleadores de SGS se puede realizar para la imagen de montaje y la dinámica particular, SGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad.
Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer la plataforma Montpellier Rio Imaging (MRI) en la que se realizaron las adquisiciones. Agradecen a Isabel Cristina López Mejía, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot y Virginie Georget por su ayuda en diferentes partes del protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
