Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta
Summary
Granuli di stress (SGS) sono granuli citoplasmatici RNA contenenti particelle in fase di stallo ribonucleoproteiche (RNP), e importante nella risposta cellulare alle varie sollecitazioni. Dinamica di SG possono essere seguite in cellule vive visualizzando la localizzazione di un componente taggato di SG in cellule primarie transfettate dopo stress.
Abstract
SGs può essere visualizzato in cellule mediante immunocolorazione delle componenti proteici specifici o polyA + mRNA. SG sono altamente dinamico e lo studio del loro assemblaggio e il destino è importante per capire la risposta cellulare allo stress. Il deficit dei fattori chiave della SG come G3BP (RasGAP SH3 dominio Binding Protein) porta a difetti dello sviluppo in topi e alterazioni del Sistema Nervoso Centrale. Per studiare la dinamica di SG in cellule di un organismo, si può cellule primarie di cultura e seguire la localizzazione di un componente etichettato transfettate di SGS. Descriviamo esperimento di time-lapse per osservare-G3BP1 contenente SG in fibroblasti embrionali di topo (MEF). Questa tecnica può anche essere usato per studiare SGS-G3BP contenente neuroni in vivo, che è cruciale come è stato recentemente dimostrato che questi SGs si formano alla insorgenza di malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. Questo approccio può essere adattato a qualsiasi altro componente corpo cellulare e proteine granuli, ed eseguitocon animali transgenici, permettendo lo studio vivo di granulati dinamiche per esempio in assenza di un fattore specifico di questi granuli.
Introduction
Granuli di stress (SGS) sono non-membranosa foci citoplasmatica formata come una risposta protettiva cellulare a stress ambientali, come la temperatura elevata, stress ossidativo, ipossia, shock osmotico, irradiazione UV, deprivazione di glucosio, o infezione virale 1. Essi possono essere indotti chimicamente mediante trattamento con composti come arsenito di sodio, che innesca lo stress ossidativo. SG accumulano in fase di stallo traduzione arrestato messaggero ribonucleoproteina (mRNPs) Complessi 2, sequestrando mRNA dal macchinario traslazionale, e il loro montaggio può essere attivato dalla fosforilazione di eIF2α (fattore di iniziazione eucariotica 2 α). SG sono strutture dinamiche che scambiano i componenti con le polisomi e altri granuli come il P-corpi. Essi costituiscono un "centro di smistamento", dove mRNA sono ordinati ed elaborati sia per la traduzione, reinitiation, il degrado o l'imballaggio in stabili mRNPs non polisomi 3. L'assemblea di SGS è veloce but è un processo graduale, con iniziali numerosi piccoli aggregati che si coagulano in granuli più grandi. L'uso di inibitori chimici che interrompono o stabilizzano i microtubuli mostra che è necessaria rete di microtubuli per dinamiche SG comprendenti processi di assemblaggio, di coalescenza e smontaggio.
L'assembly dinamico di SGS è anche favorito dalla aggregazione di specifici RNA-binding proteins (RNA-BP) come TIA-1 (T-cellulare interna antigene-1) e TIAR (proteina TIA-1-correlati), che sono in grado di dimerize e promuovere polisoma smontaggio e l'instradamento di mRNA in SG 4. G3BP (RasGAP SH3 dominio di binding protein) è tale un RNA-BP che localizza a SGS quando le cellule sono stressati con arsenito o ad alta temperatura e sovraespressione di G3BP defosforilato può indurre SG gruppo 5.
G3BP è evolutivamente conservata RNA-BP che è stato inizialmente caratterizzato attraverso la sua interazione con una proteina attivazione Ras-GTPasi (RasGAP p120 6); ma questa interazione è stato recentemente rivisitato 7. La famiglia G3BP comprende due membri nei mammiferi, G3BP1 (denominato G3BP) e G3BP2 8. Entrambe le proteine colocalize in SGS, quando le cellule sono sottoposte a stress 9. G3BPs comprendono un dominio NTF2 N-terminale suggerito di influenzare la loro localizzazione e oligomerizzazione, seguiti da prolina ricchi (PxxP) motivi, quindi motivi C-terminale associato con RNA vincolante: il canonico RNA-Riconoscimento Motif (RRM) con RNP1 e RNP2 motivi conservati , seguita da un ricco casella arginina-glicina (RGG). È interessante notare che l'analisi delle diverse parti della proteina creando diversi domini fuse ad EGFP dimostrato che il dominio NTF2-simili e il dominio legante l'RNA erano i più efficientemente assunto per SGS, suggerendo l'importanza delle proprietà di dimerizzazione e RNA vincolante l'assemblea di SGS. Diversi modelli hanno rivelato diverse funzioni delle proteine G3BP in vitro 10-13.Interruzione del G3BP nei topi hanno dimostrato l'importanza di questa proteina in crescita dello sviluppo e sopravvivenza 14, così come un ruolo importante per G3BP nel Sistema Nervoso Centrale (SNC), caratterizzata da atassia e difetti nella memoria di lavoro spaziale 15. Carenza G3BP porta ad alterata plasticità neuronale e calcio omeostasi, stabilendo un collegamento diretto tra la formazione di SG e le malattie neurodegenerative 15. È quindi importante poter studiare la dinamica dello SGS in cellule primarie come neuroni.
Questo protocollo fornisce un modo semplice per osservare l'assemblaggio di-G3BP1 contenente SG in cellule primarie in trattamento arsenite. Può essere usato per studiare assembly SGs in condizioni diverse, ad esempio diversi tipi di stress. Può anche essere adattato ad altri granuli o altri costituenti del SGS. Infatti, questo protocollo si concentra sulla G3BP1, ma ci sono altri granuli di stress marcatori come TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (fragile X ritardo mentale Sindrome di proteine) 16, TDP-43 (DNA risposta transattivo binding protein 43) 17 o Staufen 18. In particolare, proteine come TIA-1 / R sono, come G3BP, nucleazione RNA proteine leganti che possono indurre assembly SGs quando overexpressed, anche se le varie SGs formate possono differire in funzione, regolazione e trascrizioni associati. Trasfezione versione fluoroforo-tag di una di queste componenti chiave o nucleatori di SG può essere eseguita per l'immagine particolare assemblaggio e la dinamica SG.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici del protocollo riguardano la trasfezione e più in particolare le acquisizioni lasso di tempo, che devono essere attentamente monitorati al fine di abbassare la citotossicità.
Coltura di cellule primarie non è una parte difficile, finché le condizioni sterili sono mantenute e cautela è presa per evitare danni durante le fasi di dissezione e dissociazione cellulare. MEF può essere mantenuto congelato alle brevi passaggi. Neuron trasfezione con fosfato di calcio ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare la piattaforma Montpellier Rio Imaging (MRI) in cui sono state effettuate le acquisizioni. Ringraziano Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot, e Virginie Georget per il loro aiuto in diverse parti del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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