라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화
Summary
스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.
Abstract
SGS는 특정 단백질의 구성 요소 또는 폴리 A +의 mRNA의 면역 염색에 의해 세포를 시각화 할 수 있습니다. SGS는 매우 동적이며 자신의 조립과 운명의 연구는 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 중요합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)과 같은 SG를 주요 요인의 결핍 생쥐와 중추 신경계의 변화에 발달 결함이 발생합니다. 유기체, 1 캔 문화의 기본 세포에서 세포의 SG를의 역학을 연구하고 SG를의 형질 태그 구성 요소의 지역화를 수행합니다. 우리는 마우스 배아 섬유 아 세포의 G3BP1 함유 SG를 (MEFs)을 관찰하기 위해 시간 경과 실험을 설명합니다. 이 기술은 또한 최근 이러한 SG를가 알츠하이머 병 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 형성되어 도시되었을 결정적이다 라이브 뉴런 G3BP 함유 SG를 연구하는 데 이용 될 수있다. 이 방법은 임의의 다른 셀룰러 바디 및 과립 단백질 성분에 적응하고, 수행 될 수있다형질 전환 동물,이 과립의 특정 인자의 부재하에, 예를 들면 과립 역학 라이브 연구를 허용한다.
Introduction
스트레스 과립 (SGS는) 같은 높은 온도, 산화 스트레스, 저산소증, 삼투압 충격, 자외선 조사, 포도당 박탈, 또는 바이러스 감염 1과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 보호 반응으로 형성된 비 막 세포질 초점입니다. 이들은 산화 스트레스를 유발 나트륨 아비 산염과 같은 화합물로 처리함으로써 화학적으로 유도 될 수있다. SG를 실속 번역 체포 메신저 리보 (mRNPs)를 축적하면 번역 기계에서의 mRNA를 금속 이온 봉쇄, 2 단지, 자신의 어셈블리 eIF2α의 인산화 (진핵 개시 인자 2 α)에 의해 트리거 될 수 있습니다. SGS는 P-시체 같은 polysomes 및 다른 과립과 구성 요소를 교환 동적 구조입니다. 그들은의 mRNA가 정렬하고 안정적인 비 polysomal의 mRNPs 3로 번역, 재개시, 저하 또는 포장 중 하나에 대해 처리하는 "우선 순위 구분 센터"를 구성. SG를 조립 빠른 B입니다유타는 큰 과립으로 뭉쳤다 초기 다수의 작은 골재와 점진적 과정이다. 미세 소관을 중단 시키거나 안정화 화학적 억제제의 사용은 미세 소관 네트워크가 조립 합체 및 분해 공정 등 SG 역학 필요하다는 것을 보여준다.
SG를의 동적 어셈블리는 TIA-1 (T-세포 내부 항원-1)과 같은 특정 RNA 결합 단백질 (RNA-BP)의 집계에 의해 추진됩니다 TIAR 이량 할 수 있습니다 (TIA-1 관련 단백질), SGS 및 4에 polysome 분해의 mRNA의 경로를 촉진합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)의 세포가 아비 산염 또는 고온 강조하고, 탈 인산화 G3BP의 과발현이 SG를 어셈블리 (5)를 유도 할 수있을 때 SG를에 지역화와 같은 RNA-BP입니다.
G3BP는 처음 RasGAP P (라스 – GTPase의 활성화 단백질과의 상호 작용을 특징으로 한 진화 적으로 보존 된 RNA-BP입니다(120) 6); 그러나 이러한 상호 작용은 최근 7을 재 방문했다. G3BP 제품군은 두 개의 포유류의 회원, G3BP1 (G3BP이라 함)과 G3BP2 8이 포함되어 있습니다. 세포가 스트레스를 9을 실시 할 때 두 단백질은, SGS에 colocalize. 정식 RNA 인식 모티프 (RRM)를 보존 RNP1 및 RNP2 모티브 : G3BPs는 N-말단 NTF2 도메인 프롤린 리치 (PxxP) 모티프 다음에 자신의 현지화 및 올리고머를, 영향을 제안 구성, 다음 C-말단 모티브는 RNA 바인딩과 관련된 , 아르기닌 – 글리신 리치 (RGG) 상자 하였다. 흥미롭게도, EGFP 융합 다른 도메인을 구성하여 단백질의 상이한 부분을 분석 한 NTF2 같은 도메인 및 RNA-결합 도메인이 가장 효율적 이량의 특성의 중요성을 제안하는, SGS 모집 및 RNA는 바인딩 것으로 나타났다 SG를 조립. 다양한 모델은 체외 10-13에서 G3BP 단백질의 다른 기능을 공개했다.생쥐 G3BP가 중단 발달 성장과 생존 14,뿐만 아니라 공간 작업 기억 (15)에 운동 장애와 결함을 특징으로 중추 신경계 (CNS)에 G3BP의 중요한 역할이 단백질의 중요성을 보여 주었다. G3BP 결핍은 SG 형성 및 신경 퇴행성 질환 (15) 사이의 직접 링크를 설정, 변경된 신경 가소성과 칼슘 항상성에 이르게한다. 이 신경 세포와 같은 일차 전지에있는 SG를의 역학을 연구 할 수있는 것이 중요하다.
이 프로토콜은 아비 산염 처리에서 일차 전지에 G3BP1 함유 SG를 조립을 관찰 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 그것은 스트레스의 예를 다른 종류의 서로 다른 조건에서 SG를 조립을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 SG를 다른 과립 또는 다른 성분으로 구성 될 수있다. 사실,이 프로토콜은 G3BP1에 초점을 맞추고 있지만, TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2와 같은 다른 스트레스 과립 마커가있다FMRP (허약 한 X 정신 지체 증후군 단백질) 16, TDP-43 (transactive 응답 DNA 결합 단백질 43) (17) 또는 슈타우펜 18. 특히, TIA-1 / R과 같은 단백질이 과발현되면 다른 SG를 형성 기능, 규제와 관련된 성적에 차이가있다하더라도, SGS 어셈블리를 유도 할 수 RNA 결합 단백질을 핵, G3BP 같은입니다. SG를 이러한 핵심 구성 요소의 일부 또는 nucleators의 형광 – 태그 버전의 형질 이미지 특정 SG를 조립 및 역학을 수행 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 우려 형질 조심스럽게 세포 독성을 낮추기 위해 모니터링 할 필요가 더 많은, 특히 시간 경과 인수에서 가장 중요한 단계.
일차 세포의 배양 한 멸균 조건이 유지되고,주의가 절개 및 세포 분리 단계 동안의 손상을 방지하기 위해 수행되는 한, 어려운 부분이 아니다. MEFs 초기 구절에서 냉동 보관하실 수 있습니다. 칼슘과 함께 신경 세포의 형질이 잘 21 일을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인수가 수행 된 몽펠리에 리오 영상 (MRI) 플랫폼을 인정하고 싶습니다. 그들은 프로토콜의 다른 부분에서의 도움을 이사벨 로페즈 크리스티나 메 지아, 알렉산드라 메츠, 이리나 Lassot, SOLANGE Desagher, 파비앙 Loustalot 및 버지니 Georget 감사합니다. 이 작품은 라 공들인 Médicale (FRM) (퀴프 FRM 2011-N ° DEQ20111223745는) 매그가 부어 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Pre-warm at 37 °C |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Non essential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Pre-warm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Pre-warm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0,1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0,1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
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