Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos
Summary
Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.
Abstract
Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden dar lugar a la activación del complemento que resulta en un procedimiento acelerado de aprobación a través de los receptores del complemento en el hígado (hemólisis extravascular) o bien dirigiéndose a la lisis intravascular de los glóbulos rojos. Aloanticuerpos (por ejemplo ABO) o los anticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos (como se ve en la anemia hemolítica autoinmune, AHA) que conducen a la activación del complemento son potencialmente dañinas y pueden ser – especialmente cuando se conduce a la lisis intravascular – fatal 1. En la actualidad, la activación del complemento, debido a (auto)-anticuerpos en los glóbulos rojos se evalúa in vitro mediante el uso de la prueba de Coombs reflejando la deposición del complemento en eritrocitos o por un ensayo hemolítico no cuantitativo que refleja RBC lisis 1-4. Sin embargo, para evaluar la eficacia de los inhibidores del complemento, es obligatorio disponer de técnicas cuantitativas. Aquí se describen dos de estas técnicas. En primer lugar, un ensayo para detectar la deposición de C3 y C4 en las células rojas de la sangre que es inducida por anticuerpos en el suero del paciente es preSENTED. Para esto, el análisis FACS se utiliza con anticuerpos anti-C3 o anti-C4 marcados con fluorescencia. A continuación, se describe un ensayo hemolítico cuantitativa. Hemólisis mediada por el complemento En este ensayo, inducida por el suero del paciente se mide haciendo uso de la detección espectrofotométrica de la hemoglobina liberada. Ambos de estos ensayos son muy reproducible y cuantitativo, facilitar los estudios de activación del complemento inducida por anticuerpos.
Introduction
Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden ser inducidos por la transfusión de glóbulos rojos que expresan un antígeno que no está presente en los glóbulos rojos receptores. Estos aloanticuerpos pueden causar reacciones hemolíticas agudas graves de transfusión debido a la activación del complemento en la siguiente transfusión 5. En la anemia hemolítica autoinmune (AHA), los pacientes tienen autoanticuerpos contra sus propios glóbulos rojos. Esto conduce a acelerado de aprobación de las células a través de la interacción de IgG unida a los glóbulos rojos con Fc gamma-receptores en los fagocitos en el bazo y / o en caso de auto-anticuerpos capaces de activar el complemento a través de los receptores del complemento en el hígado 6,7. La activación del complemento fulminante resultando en hemólisis intravascular es raro pero a menudo mortal. Acelerado, complementar destrucción de glóbulos rojos mediada inducida por cualquiera de los resultados de alo-o autoanticuerpos en la anemia aguda y la hipoxia tisular, por tanto, potencialmente fatal. Los auto-anticuerpos en AIHA se clasifican en los anticuerpos fríos y calientes, depending de la temperatura óptima que se unen a los glóbulos rojos (37 ° C o inferior, respectivamente). Los anticuerpos calientes son por lo general de isotipo IgG y los anticuerpos fríos del isotipo IgM 8,9. AIHA puede ser secundaria a trastornos lymphoprolyferative por ejemplo, enfermedades del tejido conectivo, tumores sólidos, infecciones o medicamentos, pero en 50% de los casos AIHA es idiopática 9.
La detección de gammaglobulinas (por ejemplo. IgG o IgM) y complementar unido a glóbulos rojos del paciente se realiza por medio de una prueba de antiglobulina directa semicuantitativa (Coombs) (DAT). En el DAT glóbulos rojos del paciente se incuban con anti-IgG o anti-C3d. Ocurrencia de RBC de aglutinación demuestra la presencia de componentes del complemento adjuntos o unión de IgG. La detección de alo-o autoanticuerpos en el suero del paciente se realiza a través de la prueba de antiglobulina indirecta (IAT). En el IAT, los RBCs de ensayo tratado con bromelaína se incuban con suero de paciente, se lavaron y después se incubaron con anti-hUman IgG. En el caso de los glóbulos rojos han sido sensibilizados con anti-IgG RBC presente en la aglutinación de suero del paciente se producirá. Anticuerpos IgM contra RBC conducirán directamente a la aglutinación tras la incubación de los eritrocitos de prueba bromelina tratados con suero del paciente. RBC aglutinación en la prueba de Coombs directa o en el IAT se evaluó visualmente, ya sea por el ojo en un tubo de ensayo o mediante la carga de la muestra en una columna de Sephadex pequeña separación de los glóbulos rojos aglutinados e individuales por tamaño 1.
Otra técnica utilizada frecuentemente para medir la activación del complemento en los glóbulos rojos es el ensayo hemolítico 1, en el que se evalúa la capacidad de suero del paciente para inducir (mediada por el complemento) hemólisis de los glóbulos rojos tratado con bromelaína 10. La prueba se considera como positiva cuando el sobrenadante después de la centrifugación se tiñe de color rojo debido a la hemoglobina liberada y considera negativa si permanece incoloro. Tanto la prueba de antiglobulina y el ensayo hemolítico son semicuantitativo, puesto que la más alta Serum dilución se denota en el que la prueba es todavía positiva.
La prueba de Coombs y el ensayo hemolítico son ensayos robustos que se utilizan de forma rutinaria en el diagnóstico. Dado que estos ensayos son semicuantitativa y depende de la experiencia del técnico que realiza el ensayo no son adecuados para estudiar las diferencias sutiles de la activación del complemento en eritrocitos, según sea necesario cuando la evaluación de la eficacia de los inhibidores del complemento. Por lo tanto, hemos desarrollado dos ensayos cuantitativos para determinar la activación del complemento por la (auto)-anticuerpos contra los glóbulos rojos, que vamos a describir en este artículo.
En primer lugar, hemos desarrollado un ensayo para medir la deposición de fragmentos de activación de complemento C3 y C4 en glóbulos rojos (Figura 1A). En este ensayo, humanos tratado con bromelaína tipo-0 glóbulos rojos se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpo anti-RBC), suero AB fresco (fuente de complemento) y anticuerpo monoclonal anti-C5 (eculizumab). Durante este Incubation, C3 y C4 deposición se producirá si el suero de paciente contiene complementar la activación de anticuerpos anti-RBC. Con el fin de evitar la lisis de glóbulos rojos por la activación del complemento aguas abajo se añade un anticuerpo monoclonal anti-C5 de bloqueo. Siguiente, C3 y C4 deposición sobre el RBC es detectada por FACS utilizando anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia o fragmentos Fab que reaccionan con C3 y C4, respectivamente. Supresión de un solo RBC es importante para garantizar la fiabilidad de los resultados. Ventajas de esta técnica incluyen que se requiere un pequeño volumen de material del paciente, la activación del complemento en una etapa temprana de la cascada es evaluada y el método es reproducible y cuantitativo. Una ventaja adicional de mirar tanto C3 y C4 es que una distinción se puede hacer entre la activación clásica y de lectina vía (tanto C3 y C4 deposición) y la activación de la vía alternativa (sólo la deposición de C3). El uso de glóbulos rojos tratado con bromelaína en lugar de los glóbulos rojos sin tratar aumenta la sensibilidad de la comodecir.
El segundo ensayo se basa en el ensayo hemolítico utilizado actualmente (Figura 1B). Bromelina tratados Humanos de tipo 0 RBC se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpos anti-RBC) y suero AB fresca (fuente de complemento). Si el complemento se activa por anticuerpos anti-RBC del paciente, se producirá la lisis dependiente de la dosis de glóbulos rojos, lo que conduce a la liberación de hemoglobina. La cantidad de hemoglobina liberada se cuantificó midiendo su absorbancia a 414 nm en el sobrenadante después de centrifugar los glóbulos rojos intactos y fragmentados. La absorbancia se correlaciona con la cantidad de hemólisis producido. En contraste con el ensayo utilizado en la actualidad, este protocolo permite un objetivo, valor cuantitativo de hemólisis que es muy reproducible y no depende de la persona interpretar el ensayo.
Una aplicación de estos métodos ha sido descrita en 11, en el que el uso potencial de C1-inhibidor como inhibidor del complemento en la AIHA era studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ensayos anteriores son reproducibles y robusto. Ellos son fáciles de realizar y es posible llevar a cabo con muchas muestras al mismo tiempo (en una placa de 96 pocillos). Por lo tanto, este enfoque también sería adecuado para un sistema totalmente automatizado, por ejemplo, un sistema de robot de ELISA. En contraste con las técnicas utilizadas actualmente, estos ensayos son cuantitativos y esto ayudará por ejemplo, en el estudio del efecto de inhibidores del complemento. Por otra parte, la in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ y DW reciben una subvención sin restricciones de Viropharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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