Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi
Summary
Qui si descrivono due saggi per misurare l'attivazione del complemento indotta da anticorpi contro le cellule rosse del sangue. Il principale vantaggio rispetto ai test attuali è la loro da interpretare facile natura quantitativa e.
Abstract
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) possono portare ad attivazione del complemento con un conseguente approvazione accelerata attraverso recettori del complemento nel fegato (emolisi extravascolare) o portano alla lisi intravascolare dei globuli rossi. Alloanticorpi (ad esempio ABO) o gli anticorpi degli antigeni RBC (come si è visto in anemia emolitica autoimmune, MEA) che portano alla attivazione del complemento sono potenzialmente dannose e possono essere – soprattutto quando conduce alla lisi intravascolare – fatale 1. Attualmente, l'attivazione del complemento a causa di (auto-anticorpi) in globuli rossi viene valutata in vitro utilizzando il test di Coombs riflettendo complemento deposizione su RBC o da un saggio emolitico nonquantitative riflettendo RBC lisi 1-4. Tuttavia, per valutare l'efficacia di inibitori del complemento, è obbligatorio avere tecniche quantitative. Qui descriviamo due tali tecniche. In primo luogo, un test di rilevare C3 e C4 deposizione su globuli rossi che è indotto da anticorpi nel siero del paziente è prepresentate. Per questo, analisi FACS è usato con anticorpi anti-C3 o anti-C4 fluorescente. Accanto, un saggio emolitico quantitativo è descritto. Emolisi In questo saggio, complemento-mediata indotta dal siero del paziente viene misurata facendo uso di rilevazione spettrofotometrica della emoglobina rilasciata. Entrambi questi saggi sono molto riproducibile e quantitativa, facilitando studi di attivazione del complemento anticorpo-indotta.
Introduction
Gli anticorpi contro i globuli rossi (RBC) può essere indotta da trasfusione di globuli rossi che esprimono un antigene che non è presente in globuli rossi del destinatario. Questi anticorpi ALLO possono causare gravi reazioni trasfusionali emolitiche acute dovute a completare l'attivazione sul seguente trasfusione 5. In auto-immune anemia emolitica (MEA), i pazienti hanno auto-anticorpi contro i propri globuli rossi. Questo porta alla clearance accelerata delle cellule attraverso l'interazione di IgG legati a globuli rossi con Fcy-recettori sulla fagociti nella milza e / o in caso di auto-anticorpi capaci di attivare il complemento attraverso recettori del complemento nel fegato 6,7. Attivazione del complemento fulminante con conseguente emolisi intravascolare è rara, ma spesso fatale. Accelerata, integrare mediata distruzione RBC indotta da entrambi risultati-allo o autoanticorpi in anemia acuta e ipossia tissutale, quindi, potenzialmente fatale. Gli auto-anticorpi in MEA sono classificati in anticorpi caldi e freddi, depending della temperatura ottimale si legano a RBC (rispettivamente 37 ° C o inferiori,). Gli anticorpi caldi sono generalmente di isotipo IgG e gli anticorpi fredde del isotipo IgM 8,9. MEA può essere secondaria ad es lymphoprolyferative disturbi, malattie del tessuto connettivo, tumori solidi, infezioni o droghe, ma nel 50% dei casi è idiopatica MEA 9.
Rilevamento di gammaglobuline (ad es. IgG o IgM) e complementare legato a globuli rossi del paziente viene eseguita mediante un diretto all'antiglobulina semiquantitativa (Coombs) Test (DAT). Nella DAT globuli rossi del paziente vengono incubati con anticorpi anti-IgG o anti-C3d. Presenza di RBC agglutinazione dimostra la presenza di componenti del complemento montati o IgG vincolante. Rilevamento di-allo o autoanticorpi nel siero del paziente viene eseguita mediante il test indiretto (IAT). Nel IAT, globuli rossi prova bromelina trattati vengono incubati con siero del paziente, lavate e poi incubate con anti-hUman IgG. Nel caso in cui i globuli rossi sono stati sensibilizzati con anticorpi anti-IgG RBC presenti nel agglutinazione siero del paziente si verificherà. Anticorpi IgM anti globuli rossi saranno direttamente portare a agglutinazione su di incubazione di globuli rossi prova bromelina trattati con siero del paziente. RBC agglutinazione nel test di Coombs diretto o in IAT è valutata visivamente sia dall'occhio in una provetta o caricando il campione su una piccola colonna Sephadex separa RBC agglutinate e singoli per dimensione 1.
Un'altra tecnica frequentemente utilizzata per misurare l'attivazione del complemento su globuli rossi è il saggio emolitico 1, in cui viene valutata la capacità del siero del paziente per indurre (complemento-mediata) emolisi dei globuli rossi bromelina trattati 10. Il test è notato come positivo quando il surnatante dopo centrifugazione è macchiato rosso causa emoglobina rilasciata e considerato negativo se rimane incolore. Sia il test antiglobulina e il saggio emolitico sono semiquantitativa, poiché la massima Serum diluizione è indicato in cui il test è ancora positivo.
Il test di Coombs e il saggio emolitico sono test affidabili che sono abitualmente utilizzati nella diagnostica. Poiché questi saggi sono semiquantitativa e dipendente dall'esperienza del tecnico esecuzione del saggio non sono adatti per studiare le sottili differenze di attivazione del complemento di globuli rossi, come necessario quando valutare l'efficacia di inibitori del complemento. Pertanto, abbiamo sviluppato due analisi quantitative per determinare l'attivazione del complemento da anticorpi (auto-) per i globuli rossi, che descriveremo in questo articolo.
In primo luogo, abbiamo sviluppato un saggio per misurare la deposizione di frammenti attivazione del complemento C3 e C4 su globuli rossi (Figura 1A). In questo saggio, bromelina trattati umane di tipo-0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi), siero fresco AB (fonte complemento) e anti-C5 anticorpo monoclonale (Eculizumab). Durante questa incubation, C3 e C4 deposizione si verifica se il siero del paziente contiene completano l'attivazione di anticorpi anti-RBC. Per evitare di lisi da attivazione del complemento a valle viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti-C5 blocco. Successivamente, C3 e C4 deposizione sul globuli rossi viene rilevato mediante FACS utilizzando anticorpi monoclonali fluorescente o frammenti Fab-reagiscono con C3 e C4, rispettivamente. Gating sul singolo globuli rossi è importante per garantire l'affidabilità dei risultati. I vantaggi di questa tecnica sono che è necessaria una piccola quantità di materiale paziente, l'attivazione del complemento in una fase iniziale della cascata è valutato e il metodo è riproducibile e quantitativa. Un ulteriore vantaggio di guardare sia C3 e C4 è che una distinzione può essere fatta tra l'attivazione classica e lectina pathway (sia C3 e C4 deposizione) e l'attivazione della via alternativa (solo C3 deposizione). L'uso di GR bromelina trattato invece di eritrociti non trattati aumenta la sensibilità del comedire.
Il secondo saggio è basato sul dosaggio emolitica attualmente utilizzato (Figura 1B). Umani bromelina trattati tipo 0 globuli rossi vengono incubati con siero inattivato al calore del paziente (anti-RBC fonte anticorpi) e siero fresco AB (fonte complemento). Se complemento è attivato da anticorpi anti-RBC paziente, si verificherà dose-dipendente di lisi, porta al rilascio di emoglobina. La quantità di emoglobina rilasciata viene quantificato misurando la sua assorbanza a 414 nm nel supernatante dopo la filatura le eritrociti intatti e frammentati. L'assorbanza è correlata alla quantità di emolisi verificato. In contrasto con il dosaggio attualmente in uso, questo protocollo permette un obiettivo, valore quantitativo di emolisi che è molto riproducibile e non dipende dalla persona interpretazione del saggio.
Un'applicazione di questi metodi è stato descritto in 11, in cui l'uso potenziale di C1-inibitore come inibitore del complemento in MEA era studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dosaggi di cui sopra sono riproducibili e robusto. Essi sono di facile esecuzione ed è possibile effettuare loro con molti campioni Allo stesso tempo (in una piastra a 96 pozzetti). Pertanto, questo approccio sarebbe idoneo per un sistema completamente automatico, ad esempio un sistema robot ELISA. Contrariamente alle tecniche attualmente utilizzate, questi test sono quantitative e questo permette, ad esempio nello studio degli effetti di inibitori del complemento. Inoltre, l'interpretazione è …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ e DW ricevono una sovvenzione illimitata di Viropharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
References
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