Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.
Viral proteinlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, virüs konak etkileşimleri anlayışımızı ilerletmek için vazgeçilmez bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Çiçek hastalığının yok edilmesinde kullanılan canlı aşı olan Vaksinia virüsü (VACV), büyük virion büyüklüğü ve genom seviyesinde mühendislik kolaylığı nedeniyle floresan canlı hücreli mikroskopiye özellikle elverişlidir. Burada rekombinant virüsler üretmek için optimize edilmiş bir protokol bildiriyoruz. Yapı oluşturmanın basitleştirilmesine izin veren vaksinia replikasyonu sırasında hedeflenen homolog rekombinasyon için minimum gereksinimler belirlendi. Bu, geçici baskın seçimin (TDS) floresan bir muhabir ve metabolik seçim ile ittifakının, floresan olarak etiket viral proteinlere hızlı ve modüler bir yaklaşım sağlamasını sağladı. Floresan rekombinant virüslerin neslini kolaylaştırarak, virüs replikasyonu sırasında ortaya çıkan virüs ana bilgisayar etkileşiminin birçok yönünün gelişmiş görüntüleme analizi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırabiliyoruz.
Vaksinia virüsü (VACV) prototipik poksvirüstür ve çiçek hastalığının etken maddesi olan variola virüsü ile oldukça ilişkilidir. Bu virüslerin her ikisi de maymunpox ve ektromelia virüsü (mousepox)1gibi diğer önemli patojenleri içeren ortopedi cinsinin üyeleridir. Ortopediksler, tahmin edilen 200 açık okuma çerçevesinin2,3’ünekadar kodlayan büyük çift iplikli DNA genomlarına (180-220 kb) sahiptir. Bu virüslerin replikasyonu, olgun virüslerin (MV) yapıldığı bir perinükleer virüs fabrikasının ve MV’nin bir alt kümesinin sarılmış virüsler (WV) oluşturmak için iki ek membran edindiği trans-Golgi ağının oluşumunu içerir (Roberts ve Smith4tarafından incelenmiştir). Ortopedik genomlar, VACV genom replikasyonunun bir özelliği olan ve viral DNA polimeraz5tarafından aracılık edilen yüksek derecede genetik rekombinasyon nedeniyle genetik manipülasyona oldukça elverişlidir. Rekombinant virüslerin üretilmesi, vaksinia virüslü hücrelerde rekombinasyona aracılık etmek için yeterli olan 12 bp kadar küçük homologlara sahip homolog rekombinasyon ve doğrusal DNA moleküllerine dayanır6. Vaksinia virüsünün floresan etiketlemesi, virion başına birçok floresan proteinin birleştirilmesine izin veren ortopedik parçacıkların büyüklüğü nedeniyle son derece parlak virüs parçacıkları verebilir7. Vaccinia, yabancı DNA8’in büyük parçalarını taşıma kapasitesine sahiptir ve ayrıca, sert kapsid simetri eksikliği, endojen loci9’larındanviral protein gen füzyonlarını ifade ederken bir dereceye kadar esneklik sağlayabilir. VACV proteinlerinin floresan etiketlemesi, özellikle virüs girişi10, transport 11-13ve morfogenez, özellikle sarılmış virionlar7alanında, hücre altı düzeydekonak-patojenetkileşimlerinin incelenmesi için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır.
Rekombinant virüsler zayıflatılmış büyüme fenotipi14,15, metabolik seleksiyon16-18veya bir işaret geninin ekspresy ekspresyasyonu ile seçilebilir (örneğin X-gal19 veya floresan protein13,20). Burada floresan ve metabolik seçimin güçlü bir kombinasyonunu kullanarak floresan virüslerin seçimini açıklıyoruz. Faulkner ve Moss (1990)21tarafından geliştirilen geçici baskın seleksiyon (TDS) vektörleri, işaretleyicilerin istenen floresan etiketli ilgi geni ile birlikte entegre edilmesine izin verir. Metabolik seleksiyon çıkarıldığında, seçim genlerini ekseren, ancak floresan etiketli virüs proteinini sağlam bırakan ikincil bir rekombinasyon olayı meydana gelebilir. Aşağıdaki Şekil 2 deneysel prosedüre genel bir bakış sunmaktadır. Bu çalışmada kullanılan seçim genleri mCherry ve Escherichia coli guanine fosforibosyltransfeaz(gpt)genidir, her ikisi de sentetik erken / geç viral promotörden ifade edilir ve daha önce Cordeiro ve ark. 22 Ek olarak, ilgi çekici etiketli füzyon proteininin floresan vardır. Metabolik seçim kaldırıldığında, seçilebilir belirteçler (mCherry ve gpt) çıkarılır, sadece doğru rekombinant virüslerin tanımlanmasına izin veren etiketli genin floresanını bırakır. Seçim işaretleyicilerinin eksizyonu, birden fazla floresan etiketi birleştirme imkanı sağlar ve aynı anda birkaç viral proteini floresan olarak etiketleme yeteneğine sahip virüsler oluşturmamızı sağlar. Önceki çalışmalar, vaksinia virüslü hücrelere transklüzyona bulaşan doğrusal ve dairesel DNA moleküllerinin vaksinia rekombinasyonu için minimum homoloji gereksinimlerinibelirlemiştir 6. Gpt-mCherry TDS vektöründeki farklı homoloji uzunluklarındaki kanatlanma kollarının rekombinasyon verimliliklerini vaccinia viral genomuna dahil edilmesi yoluyla belirlemek istedik. TDS vektöründeki 100 bp’lik homolog bölgelerin, homolog rekombinasyon ile rekombinant DNA’nın VACV genomuna yerleştirilmesini hedeflemek ve aracılık etmek için yeterli olduğu belirlenmiştir (Şekil 4). Daha küçük homoloji uzunlukları da rekombinasyona olanak sağlarken, 100 bp homoloji uzunlukları metabolik ve floresan seçimle kolayca tanımlanabilecek yeterli rekombinant virüs sağladı. Bu büyüklükteki DNA parçaları nispeten düşük maliyetle ticari olarak sentezlenebilir ve rekombinant virüslerin oluşturulması için birden fazla vektörün üretimini büyük ölçüde kolaylaştırır. Yan bölgelerin oligonükleotid dizisinin sentez maliyetlerini düşük tutarken daha fazla rekombinasyon sıklığı sağlamak için homoloji uzunluğunu 150 bp’ye çıkarmayı tercih ettik.
Bu teknik, floresan etiketli viral proteinleri ifade eden rekombinant virüslerin oluşturulması için etkili ve modüler bir protokolü açıklar. Yöntem, viral genomdaki tek değişikliğin, geride seçim işareti bırakmadan bir etiket veya işaretleyici eklenmesi olmasını sağlar. Homolog rekombinasyon için gereken kısa kol uzunluğu, doğrudan sentezini sağlar, pcr ve klonlamanın birkaç zaman alıcı turunu ortadan kaldırırken, mCherry ve metabolik GPT seçiminin floresanları viral rekombinasyon aralarını izole etmek için kullanılır. Bu ara ürünler, seçimin kaldırılmasını takiben, etiketli bir gene sahip bir virüse veya ebeveyn tipine geri çözülebilir. Hem floresan hem de metabolik seleksiyon kullanımını içeren benzer bir yöntem daha önce27 olarak tanımlanmıştır, ancak bu çalışmada kullanılan yöntem homolojinin daha kısa, sentezlenmiş bölgelerini kullanarak, ilgi çekici etiketli genin floresanını görüntüleyerek istenen rekombinant virüsün tanımlanmasını sağlar. Bu ikincil seçim sadece bir plak testinde yeterli floresan üreten yüksek oranda ifade edilen viral genlerin etiketlenmesi için geçerlidir. Alternatif olarak, örneğin güçlü bir viral promotör altında floresan bir protein gibi tam bir ifade kasetinin yerleştirilmesini öngörebilirim. Bu durumda sol ve sağ kollar etiketlenecek viral gen yerine ekleme noktasını tanımlar.
Deneysel prosedür sırasında yararlı olduğu kanıtlandı bazı önemli adımlar vardır. Yukarıda açıklanan adım 2.3.3’teki sıvı kaplama, kırmızı/yeşil floresan plakların tespiti ve izolasyonu için çok önemli olduğunu kanıtladı. GPT seçim reaktifleri ve agarose kaplamasının kombinasyonunun rekombinant virüslerin büyümesini caydırdığını ve bu nedenle transfeksiyondan sonra virüsleri güçlendirmenin ilk adımı için sıvı bir kaplamaya geçtiğini inanıyoruz. Sol kol rekombinasyonundan kaynaklanan ara ürünler, sol kolda da bir promotör dizisi içeriyorsa plaklarda gözlenen yaygın floresan ile sonuçlanabileceğinden, zenginleştirme ve saflaştırma için lokalize etiket rengi floresan gösteren floresan plakların seçimi de önemlidir. TDS vektöründeki mCherry işaret geni de gfpile değiştirilebilir , örneğin, mCherry’nin floresan etiketi olarak kolayca birleştirilmesine ve seçilmesine izin vermek için.
Yukarıda açıklanan bazı teknikler, rekombinant vaksinia virüsü oluşturmanın yerleşik yöntemlerinden biraz farklılık gösterir. Örneğin, rekombinant oluşturmak için kullanılan virüsün MOI’si normalde1 28‘den azdır , ancak daha yüksek MOI’lerin kullanımı bu yöntemle rekombinant vaksinia virüsünün oluşturulması için yeterli olmuştur. GPT seçim reaktiflerinin kullanımı normalde hücrelerin seçim reaktifleri18ile önkökasyonunu gerektirir , ancak enfeksiyon sonrası kurtarma aşamasında eklenmesi, özellikle floresan seçim işaretleyicisinin varlığı nedeniyle hala istenen rekombinantların yeterli seçimini sağladı.
Daha önce de belirtildiği gibi, bu tekniğin sınırlamalarından biri, ikincil floresan seçim adımının, bir plak testinde gözle algılanmasını sağlayan bir düzeyde, ilgi çekici etiketli proteinin yüksek oranda ifade edilmesine dayanmasıdır. Bu olmadan, sadece mCherry floresan sergileyen virüsleri arındırmak mümkün olacaktır, bunlardan en az% 50’si, yukarıdaki adım 2.12’de açıklanan PCR gibi moleküler stratejilerle tanımlanabilecek istenen rekombinant virüsleri içerecektir. Diğer bir sınırlama, etiketlemelerinin bir sonucu olarak bazı proteinlerin inaktivasyonu olabilir. Floresan etiketi mutasyona uğrayabilir veya zaman içinde geçen rekombinant virüs tarafından eksantasyona uğrayabilir. Bu nedenle rekombinant virüs stoklarının mikroskopi ve PCR ile düzenli örneklemesi önerilir. Son olarak, tek bir virüse dahil edilebilen floresan etiketli proteinlerin sayısının bir sınırı olabilir. Bunun bir yönü, hepsini aynı anda görselleştirme yeteneğidir; mevcut floresan etiketlerin emisyon spektrumunun çakışan doğası göz önüne alındığında, minimum spektral kanama sağlamak için bunları dikkatlice seçmek önemlidir. Ek olarak, GFP ve Cerulean gibi yakından ilişkili etiketlerin kullanılması, rekombinant genomdaki konumlarına bağlı olarak ikisi arasında yeniden birleştirme olasılığını açar.
Bu tekniğin modüler yapısı, floresan etiketlerin diğer boyama ve/veya etiket seçenekleriyle uyumluluğa dayalı olarak basit bir şekilde değiştirilmesini sağlar. Seçilebilir belirteçleri uyararak, TDS yöntemi çeşitli floresan proteinlerin seri olarak eklenmesine veya fenotipik analizler için TDS tabanlı gen silme ile TDS tabanlı etiketlemenin kombinasyonuna izin verir29. Bu yaklaşımın yararı için bir örnek olarak, virüs çekirdeklerini ve WV zarını etiketleyen çift etiketli bir floresan virüs oluşturuldu. Bu virüsle yapılan görüntüleme çalışmaları, virüs replikasyon sırasında virüsün hareketini, morfogenezini ve sarılmasını incelemek için kullanılabilir. Henüz keşfedilmemiş vaksinia viral proteinleri de bu teknikle etiketlenebilir ve incelenebilir.
Vaksinia virüsü, canlı hücreli mikroskopiye elverişli olan virüsün birçok özelliği nedeniyle görüntüleme çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Floresan etiketler viral genomdan ifade edilir, transfeksiyon ihtiyacını ortadan kaldırır, enfekte hayvanlardan veya dönüştürülemez hücrelerden elde edilen birincil hücrelerin kolayca analiz edilmesine olanak tanır. Başlangıçta, floresan VACV’ler virüs hareketinin basit hücre altı takibi için kullanıldı30, ancak daha yeni yaklaşımlar FRET çalışmaları31, tek virüs parçacıklarında FRAP32, promotör muhabirleri33, intravital görüntüleme34ve yapısal çalışmalar35-37‘yi içerecek şekilde yardımcı programını genişletti. Tüm bu teknikler, rekombinant floresan virüsler oluşturma yöntemi ile birlikte daha kolay ve daha yakın ulaşılabilir olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Federasyon Keşif Projesi hibe #1096623 tarafından finanse edildi.
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |