Qui viene descritto un protocollo rapido e modulare per la generazione di virus vaccinia ricombinanti che esprimono simultaneamente proteine contrassegnate fluorescentmente utilizzando il metodo della selezione dominante transitoria.
L’etichettatura delle proteine virali con proteine fluorescenti ha dimostrato un approccio indispensabile per promuovere la nostra comprensione delle interazioni virus-ospite. Il virus Vaccinia (VACV), il vaccino vivo utilizzato nell’eradicazione del vaiolo, è particolarmente suscettibile di microscopia fluorescente a cellule vive grazie alle sue grandi dimensioni di virione e alla facilità con cui può essere progettato a livello genomico. Qui viene segnalato un protocollo ottimizzato per la generazione di virus ricombinanti. Sono stati determinati i requisiti minimi per la ricombinazione omologa mirata durante la replicazione della vaccinia, che consente la semplificazione della generazione di costrutti. Ciò ha permesso l’alleanza della selezione dominante transitoria (TDS) con un reporter fluorescente e la selezione metabolica per fornire un approccio rapido e modulare alle proteine virali fluorescenti. Semplificando la generazione di virus ricombinanti fluorescenti, siamo in grado di facilitare applicazioni downstream come l’analisi avanzata dell’imaging di molti aspetti dell’interazione virus-host che si verifica durante la replicazione dei virus.
Il virus vaccinia (VACV) è il poxvirus prototipale e altamente correlato al virus della variola, l’agente causale del vaiolo. Entrambi questi virus sono membri del genere ortopox che include altri agenti patogeni degni di nota come monkeypox e virus ectromelia (toppox)1. Gli ortopoxvirus hanno grandi genomi di DNA a doppio filamento (180-220 kb) che codificano verso l’alto di 200 fotogrammi di letturaaperti previsti 2,3. La replicazione di questi virus comporta la formazione di una fabbrica di virus perinucleari, dove sono fatti virus maturi (MV), e la rete trans-Golgi dove un sottoinsieme di MV acquisisce due membrane aggiuntive per generare virus avvolti (WV) (esaminati da Roberts e Smith4). I genomi ortopox sono altamente suscettibili alla manipolazione genetica a causa dell’alto grado di ricombinazione genetica che è una caratteristica della replicazione del genoma VACV ed è mediato dalla DNA polimerasi virale5. La generazione di virus ricombinanti si basa sulla ricombinazione omologa e su molecole lineari di DNA con omologie di appena 12 bp sufficienti a mediare la ricombinazione nelle cellule infettate da virus vaccinia6. L’etichettatura fluorescente del virus vaccinia può produrre particelle di virus estremamente luminose a causa delle grandi dimensioni delle particelle di ortopox, che consente l’incorporazione di molte proteine fluorescenti pervirione 7. Vaccinia ha la capacità di trasportare grandi frammenti di DNAestraneo 8 e, inoltre, la mancanza di simmetria rigida del capsid può consentire un certo grado di flessibilità nell’esprimere fusioni geniche proteiche virali dal loro loci endogeno9. L’etichettatura fluorescente delle proteine VACV si è dimostrata preziosa per lo studio delle interazioni ospite-patogeno a livello subcellulare, in particolare nel campo dell’ingresso del virus10,del trasporto 11-13e della morfogenesi, in particolare dei virioni avvolti7.
I virus ricombinanti possono essere selezionati salvando un fenotipo di crescita attenuato14,15, selezione metabolica16-18o per espressione di un gene marcatore(ad esempio X-gal19 o proteinafluorescente 13,20). Qui descriviamo la selezione di virus fluorescenti utilizzando una potente combinazione di selezione fluorescente e metabolica. I vettori di selezione dominante transitoria (TDS), sviluppati da Faulkner e Moss (1990)21,consentono di integrare i marcatori insieme al gene di interesse contrassegnato fluorescentmente desiderato. Quando la selezione metabolica viene rimossa, può verificarsi un evento di ricombinazione secondario che asporta i geni di selezione, ma lascia intatta la proteina virale contrassegnata fluorescentmente. La figura 2 che segue fornisce una panoramica della procedura sperimentale. I geni di selezione utilizzati in questo studio sono mCherry e il gene Escherichia coli guanina fosforibosiltransferasi (gpt), entrambi espressi da un promotore virale sintetico precoce/tardivo e usati in precedenza da Cordeiro et al. 22 Inoltre, vi è fluorescenza della proteina di fusione taggata di interesse. Quando la selezione metabolica viene rimossa, i marcatori selezionabili (mCherry e gpt) vengono asportati, lasciando solo la fluorescenza del gene taggato, che consente l’identificazione dei virus ricombinanti corretti. L’escissione dei marcatori di selezione offre la possibilità di combinare più tag fluorescenti, consentendoci di creare virus con la capacità di etichettare fluorescentmente diverse proteine virali contemporaneamente. Studi precedenti hanno determinato i requisiti minimi di omologia per la ricombinazione vaccinia di molecole di DNA lineari e circolari trasfette in cellule infettate da virus vaccinia6. Volevamo determinare l’efficienza di ricombinazione di varie lunghezze di omologia dei bracci di fianco nel vettore TDS gpt-mCherry attraverso la sua incorporazione nel genoma virale di Vaccinia. È stato determinato che le regioni omologhe di 100 bp nel vettore TDS sono sufficienti per colpire e mediare l’inserimento del DNA ricombinante nel genoma VACV mediante ricombinazione omologa (Figura 4). Mentre lunghezze di omologia più piccole consentirebbero anche la ricombinazione, le lunghezze di omologia di 100 bp fornivano abbastanza virus ricombinanti che potevano essere facilmente identificati con la selezione metabolica e fluorescente. Frammenti di DNA di queste dimensioni possono essere sintetizzati commercialmente a costi relativamente bassi e facilitano notevolmente la produzione di più vettori per la creazione di virus ricombinanti. Abbiamo optato per aumentare la lunghezza dell’omologia a 150 bp per fornire una maggiore frequenza di ricombinazione mantenendo bassi i costi di sintesi della sequenza oligonucleotide delle regioni di fianco.
Questa tecnica descrive un protocollo efficiente e modulare per la creazione di virus ricombinanti che esprimono proteine virali contrassegnate fluorescentmente. Il metodo garantisce che l’unica modifica al genoma virale sia l’aggiunta di un tag o di un marcatore, senza lasciare alcun marcatore di selezione. La breve lunghezza del braccio richiesta per la ricombinazione omologa ne consente la sintesi diretta, eliminando diversi cicli dispendiosi in termini di tempo di PCR e clonazione, mentre la fluorescenza della selezione di mCherry e GPT metabolica viene utilizzata per isolare gli intermedi di ricombinazione virale. Questi intermedi possono essere risolti, dopo la rimozione della selezione, in un virus con un gene taggato o di nuovo al tipo parentale. Un metodo simile che prevede l’uso della selezione sia fluorescente che metabolica è stato descritto inprecedenza 27, sebbene il metodo utilizzato in questo studio utilizzi regioni di omologia più brevi e sintetizzati, consentendo l’identificazione del virus ricombinante desiderato imagingndo la fluorescenza del gene taggato di interesse. Questa selezione secondaria è applicabile solo per l’etichettatura di geni virali altamente espressi che producono fluorescenza sufficiente in un saggio di placca. In alternativa, si potrebbe prevedere l’inserimento di una cassetta di espressione completa, ad esempio una proteina fluorescente sotto un forte promotore virale. In questo caso le braccia sinistra e destra definirebbero il punto di inserimento piuttosto che il gene virale da taggare.
Ci sono alcuni passaggi chiave che si sono rivelati utili durante la procedura sperimentale. La sovrapposizione liquida nel passaggio 2.3.3 sopra descritta si è rivelata cruciale per il rilevamento e l’isolamento delle placche fluorescenti rosso/verde. Riteniamo che la combinazione dei reagenti di selezione GPT e della sovrapposizione di agarosio abbia scoraggiato la crescita dei virus ricombinanti e quindi sia passata a una sovrapposizione liquida per il primo passo di amplificazione dei virus dopo la trasfezione. È anche importante scegliere placche fluorescenti che mostrino fluorescenza localizzata del colore delle targhe per l’arricchimento e la purificazione, poiché gli intermedi risultanti dalla ricombinazione del braccio sinistro possono causare fluorescenza diffusa osservata nelle placche se il braccio sinistro contiene anche una sequenza di promotori. Il gene marcatore mCherry nel vettore TDS può anche essere sostituito da gfp, ad esempio, per consentire la facile incorporazione e selezione di mCherry come tag fluorescente.
Alcune tecniche sopra descritte variano leggermente dai metodi stabiliti per creare il virus vaccinia ricombinante. Ad esempio, il MOI del virus utilizzato per creare ricombinanti è normalmente inferiore a 128, tuttavia l’uso di IBI più elevati è stato sufficiente per la creazione di virus vaccinia ricombinante con questo metodo. L’uso di reagenti di selezione GPT richiede normalmente la preincubazione delle cellule con reagenti diselezione 18,tuttavia aggiungendoli durante la fase di salvataggio post-infezione ha comunque fornito una selezione sufficiente dei ricombinanti desiderati, in particolare a causa della presenza di un marcatore di selezione fluorescente.
Come accennato in precedenza, uno dei limiti di questa tecnica è che la fase di selezione della fluorescenza secondaria si basa sul fatto che la proteina taggata di interesse sia altamente espressa, ad un livello che consente il suo rilevamento a occhio in un saggio di placca. Senza questo, sarebbe possibile purificare i virus che mostravano solo fluorescenza mCherry, di cui almeno il 50% conterrebbe i virus ricombinanti desiderati, che potrebbero essere identificati da strategie molecolari come la PCR descritta al precedente passaggio 2.12. Un’altra limitazione potrebbe essere l’inattivazione di alcune proteine come risultato del loro tagging. Il tag fluorescente può subire mutazioni o essere asportato dal virus ricombinante con passaging nel tempo. Pertanto, si raccomanda un campionamento regolare delle scorte di virus ricombinanti mediante microscopia e PCR. Infine, potrebbe esserci un limite al numero di proteine contrassegnate fluorescentmente che possono essere incorporate in un singolo virus. Un aspetto di questo è la capacità di visualizzarli tutti contemporaneamente; data la natura sovrapposta degli spettri di emissione dei tag fluorescenti disponibili, è importante selezionarli con attenzione per garantire un’esentata spettrale minima. Inoltre, l’uso di tag strettamente correlati come GFP e Cerulean apre la possibilità di ricombinazione tra i due, a seconda della loro posizione nel genoma ricombinante.
La natura modulare di questa tecnica consente la semplice sostituzione dei tag fluorescenti in base alla compatibilità con altre scelte di colorazione e/o tag. Con l’accisa di marcatori selezionabili, il metodo TDS consente l’aggiunta seriale di varie proteine fluorescenti o la combinazione di tagging basato su TDS con deezioni geniche basate su TDS per analisi fenotipiche29. Ad esempio per l’utilità di questo approccio, è stato generato un virus fluorescente a doppia taggazione che etichetta i nuclei dei virus e la membrana WV. Studi di imaging con questo virus potrebbero essere utilizzati per studiare il movimento, la morfogenesi e l’avvolgimento del virus durante la replicazione del virus. Ancora non caratteristiche vaccinia proteine virali possono anche essere taggati e studiati con questa tecnica.
Il virus vaccinia è stato ampiamente utilizzato negli studi di imaging a causa di molte caratteristiche del virus che sono favorevoli alla microscopia a cellule vive. I tag fluorescenti sono espressi dal genoma virale, eliminando la necessità di trasfezione, consentendo di analizzare facilmente le cellule primarie derivate da animali infetti o cellule non trasffetbili. Inizialmente, i VAV fluorescenti sono stati utilizzati per il semplice tracciamento subcellulare del movimento del virus30, ma approcci più recenti hanno ampliato la loro utilità per includere studi FRET31, FRAP a singole particelle di virus32, giornalisti promotori33,imaging intravitale34e studi strutturali35-37. Tutte queste tecniche potrebbero essere più facili e più vicine insieme a questo metodo per creare virus fluorescenti ricombinanti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione the Australian Research Council Federation Discovery Project #1096623.
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |