此处描述了一种快速和模块化的协议,用于生成重组疫苗病毒,同时使用瞬时主导选择的方法表达荧光标记的蛋白质。
用荧光蛋白标记病毒蛋白已被证明是促进我们对病毒宿主相互作用的理解不可或缺的方法。疫苗病毒(VACV)是用于消灭天花的活疫苗,由于其巨大的病毒大小和在基因组水平上易于设计,因此特别容易用于荧光活细胞显微镜。我们在这里报告生成重组病毒的优化协议。确定了疫苗复制期间有针对性的同源重组的最低要求,从而简化了构造生成。这使得瞬时主导选择 (TDS) 与荧光报告器和代谢选择的联盟能够提供快速和模块化的方法来荧光标记病毒蛋白。通过简化荧光重组病毒的生成,我们能够促进下游应用,例如对病毒复制过程中发生的病毒-宿主相互作用的许多方面进行高级成像分析。
疫苗病毒 (VACV) 是原毒痘病毒,与天花的致病剂 Variola 病毒密切相关。这两种病毒都是矫形器属的成员,包括其他著名的病原体,如猴痘和直肠病毒(鼠标痘)1。矫形病毒有大型双链DNA基因组(180-220 kb),编码超过200个预测的开放读数帧2,3。这些病毒的复制涉及形成一个跨核病毒工厂,在那里制造成熟的病毒(MV),以及一个跨戈尔吉网络,其中MV的子集获得两个额外的膜来生成包裹的病毒(WV)(由罗伯茨和史密斯4审查)。矫形器基因组高度适应基因操纵,由于高度的基因重组,这是VACV基因组复制的一个特点,并由病毒DNA聚合酶5调解。产生重组病毒依赖于同源重组和线性DNA分子,同源性小至12bb足以调解疫苗病毒感染细胞6的重组。由于矫形器颗粒体积大,疫苗病毒的荧光标签可以产生极其明亮的病毒颗粒,这使得每个病毒7含有许多荧光蛋白。Vaccinia 有能力携带大量外来 DNA8 的片段,此外,缺乏刚性对称性可能允许在表达病毒蛋白基因融合时具有一定程度的灵活性,从其内源性叶9 。事实证明,VACV蛋白的荧光标记对研究细胞下的宿主-病原体相互作用,特别是在病毒进入10、运输11-13和形态形成领域,特别是包裹病毒7的研究,具有宝贵的价值。
重组病毒可以通过分离衰减生长表型14,15,代谢选择16-18,或通过表示标记基因(如X-gal19或荧光蛋白13,20)来选择。在这里,我们使用荧光和代谢选择的强大组合来描述荧光病毒的选择。由福克纳和莫斯(1990)21开发的瞬态主导选择(TDS)载体,允许标记与所需的荧光标记感兴趣的基因集成。当代谢选择被去除时,可能发生二次重组事件,切除选择基因,但保持荧光标记的病毒蛋白完好无损。下图2概述了实验过程。本研究中采用的选择基因是mCherry和大肠杆菌瓜宁磷脂转移酶(gpt)基因,均表示来自合成的早期/晚病毒促进剂,并曾被科尔代罗等人使用。22此外,还有感兴趣的标记融合蛋白的荧光。删除代谢选择时,可选标记(mCherry和gpt)被切除,只留下标记基因的荧光,从而允许识别正确的重组病毒。选择标记的切除提供了组合多个荧光标签的可能性,使我们能够创建病毒,同时对几个病毒蛋白进行荧光标记。先前的研究已经确定了疫苗重组线性和圆形DNA分子的最小同源要求,这些分子被转化为接种疫苗病毒感染的细胞6。我们希望通过将gpt-mCherry TDS载体纳入疫苗病毒基因组,确定gpt-mCherry TDS载体侧翼手臂不同同源长度的重组效率。经确定,TDS载体中100 bp的同源区域足以通过同源重组(图4)定位和调解将重组DNA插入VACV基因组。虽然较小的同源长度也能够重组,但 100 bp 同源长度提供了足够的重组病毒,这些病毒可以很容易地识别出代谢和荧光选择。这种大小的DNA片段可以以相对较低的成本进行商业合成,并大大促进多个载体的产生,以产生重组病毒。我们选择将同源长度增加到 150 bp,以提供更大的重组频率,同时降低侧翼区域寡核苷酸序列的合成成本。
该技术描述了一种高效和模块化的协议,用于创建重组病毒,以表达荧光标记的病毒蛋白。该方法确保病毒基因组的唯一变化是添加标签或标记,不留下任何选择标记。同源重组所需的短臂长使其能够直接合成,消除数轮耗时的 PCR 和克隆,同时使用 mCherry 和代谢 GPT 选择的荧光来隔离病毒重组中间体。这些中间体可以在选择删除后,解决给带有标记基因的病毒或返回到父型的病毒。先前曾 描述过一种涉及荧光和代谢选择的类似方法,尽管本研究中使用的方法利用了较短的合成同源区域,通过成像标记的兴趣基因的荧光来识别所需的重组病毒。这种二次选择仅适用于标记在斑块测定中产生足够荧光的高度表达的病毒基因。或者,人们可以设想插入一个完整的表达盒,例如在强大的病毒促进剂下的荧光蛋白。在这种情况下,左右臂将定义插入点,而不是标记病毒基因。
在实验过程中,有一些关键步骤被证明是有帮助的。上述步骤 2.3.3 中的液体覆盖物对于检测和隔离红/绿荧光斑至关重要。我们认为,GPT选择试剂和阿加罗斯叠加的组合洗涤了重组病毒的生长,因此在转染后,转向液体覆盖,以扩大病毒的第一步。挑选显示局部标记彩色荧光的荧光牌也很重要,因为左臂重组产生的中间体如果左臂还包含促进器序列,则可能导致斑块中观察到的弥漫荧光。TDS载体中的 mCherry 标记基因也可能被 gfp所取代,例如,允许将 mCherry 作为荧光标签进行简单的整合和选择。
上述一些技术与创建重组疫苗病毒的既定方法略有不同。例如,用于制造重组剂的病毒的MOI通常小于128,但使用较高的MOI已足以通过这种方法产生重组疫苗病毒。使用 GPT 选择试剂通常需要用选择试剂18预孵化细胞,但在感染后的抢救阶段添加它们仍然提供了足够的选择所需的重组剂,特别是由于存在荧光选择标记。
如前所述,该技术的局限性之一是,二次荧光选择步骤依赖于高度表达的兴趣标记蛋白,其水平能够在斑块检测中通过眼睛检测。如果没有这一点,就有可能净化只表现出 mCherry 荧光的病毒,其中至少50%将含有所需的重组病毒,这些病毒可以通过分子策略(如上图第2.12步所述的PCR)来识别。另一个限制可能是某些蛋白质由于标记而失活。荧光标签可能会发生突变或被重组病毒切除,并随着时间的推移而传播。因此,建议通过显微镜和 PCR 定期抽取重组病毒库存。最后,可以纳入单一病毒的荧光标记蛋白质的数量可能会受到限制。其中一个方面是能够同时可视化它们:鉴于现有荧光标签的排放光谱重叠,必须仔细选择它们,以确保最小的光谱出血。此外,使用密切相关的标签,如GFP和Cerulean,根据它们在重组基因组中的位置,打开了两者重组的可能性。
该技术的模块化性质使荧光标签能够基于与其他染色和/或标签选择的兼容性进行简单的替代。通过切除可选标记,TDS 方法允许连续添加各种荧光蛋白,或将基于 TDS 的标记与基于 TDS 的基因删除相结合,用于表型分析29。作为此方法的效用的一个例子,生成了一种双标记荧光病毒,该病毒标记了病毒核心和 WV 膜。这种病毒的成像研究可用于研究病毒复制过程中病毒的运动、形态形成和包装。尚未特有疫苗病毒蛋白也可能被标记和研究的这项技术。
由于该病毒的许多特征有利于活细胞显微镜,疫苗病毒在成像研究中得到了广泛的应用。荧光标签来自病毒基因组,无需转染,使从受感染动物或不可传播细胞中提取的原细胞能够轻松分析。最初,荧光VACV用于简单的细胞内病毒运动30跟踪,但最近的方法已经扩大其效用,包括FRET研究31,FRAP在单个病毒粒子32,促进记者33,内在成像34,结构研究35-37。所有这些技术都可以更容易和更接近,再加上这种方法,创造重组荧光病毒。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由澳大利亚研究理事会联合会发现项目赠款资助,#1096623。
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |