Expresión de funcionales recombinante hemaglutinina y neuraminidasa Proteínas del Virus Novel H7N9 Influenza usando el sistema de expresión de baculovirus
Summary
Aquí se describe una forma de expresar antígenos de superficie del virus de la influenza correctamente plegadas y funcionales derivadas del nuevo virus H7N9 chino en células de insecto. La técnica se puede adaptar para expresar ectodominios de cualquiera de las proteínas de superficie virales o celulares.
Abstract
El sistema de expresión de baculovirus es una herramienta poderosa para la expresión de proteínas recombinantes. Aquí lo utilizamos para producir versiones correctamente plegadas y glicosilados de la influenza A virus glicoproteínas de superficie – la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). A modo de ejemplo, hemos elegido las proteínas HA y NA expresadas por el nuevo virus H7N9 que emergió recientemente en China. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para las proteínas HA y NA expresadas por cualquier otro de la gripe A y B cepas de virus. Proteínas recombinantes HA (rHA) y NA (ARN) son reactivos importantes para ensayos inmunológicos tales como ELISPOT y ELISA, y también son de uso generalizado para la normalización de la vacuna, el descubrimiento de anticuerpos, el aislamiento y la caracterización. Además, las moléculas de NA recombinantes pueden usarse para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas y son útiles para la caracterización de la función enzimática de la AN, así como su sensibilidad a los antivirales. Proteínas HA recombinantes también son being probado como vacunas experimentales en modelos animales, y una vacuna basada en HA recombinante fue autorizado recientemente por la FDA para su uso en seres humanos. El método como se describe aquí para producir estas moléculas es sencillo y puede facilitar la investigación en laboratorios de la gripe, ya que permite la producción de grandes cantidades de proteínas rápidas y a un bajo costo. Aunque aquí nos centramos en las glicoproteínas de superficie del virus de la gripe, este método también puede ser usado para producir otras proteínas de superficie virales y celulares.
Introduction
Como primera respuesta a la reciente aparición de la nueva cepa del virus de la influenza H7N9 en China, adquirimos plásmidos portadores de las secuencias genómicas de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) genes de los dos primeros aislamientos. El uso de estos plásmidos que pudimos construir rápidamente los vectores de expresión de baculovirus para la producción de HA y NA recombinante en células de insecto. Este sistema de expresión está bien establecida en nuestro laboratorio y ha demostrado ser fundamental para muchos de nuestros proyectos de investigación en curso 1-8. Las células de insectos son capaces de doblar correctamente y después de la traducción modificar proteínas complejas. Estas modificaciones incluyen la glicosilación ligada a N, lo cual es importante para muchas glicoproteínas virales. Como tal, no es sorprendente que el sistema de baculovirus es bastante establecido para la expresión de antígenos de superficie del virus de la gripe. De hecho, muchas de las estructuras cristalinas de HA y NA han sido resueltos utilizando proteínas de las células de insectos expresado 9-11. Otra ventaja de lasistema se encuentra en sus rendimientos fiables de alto valor proteico de hasta 30 mg de cultivo celular HA / L (en base a nuestra experiencia con más de 50 diferentes proteínas HA) – Una consecuencia de la expresión dirigida por virus la infección por el fuerte promotor de la polihedrina.
La eliminación de la transmembrana y endodominio de las proteínas HA y NA permite la expresión de versiones secretables, solubles de las proteínas y por lo tanto facilita en gran medida el proceso de purificación. Además, estos ectodominios se hexahistidina etiquetados y por lo tanto se pueden purificar utilizando cromatografía de afinidad utilizando Ni 2 +-resina. Los dominios transmembrana de las proteínas HA y NA contribuyen a la formación de homotrímero y homotetrámero, respectivamente. Con el fin de preservar estas oligomerizaciones, se añade un dominio de trimerización C-terminal para el HA-, y un tetramerización dominio N-terminal a la AN construcciones (Figura 1). Hemos demostrado de manera concluyente que tal dominio de trimerización estabiliza funcional, conserved epítopos conformacionales en el tallo en el dominio de HA 1. El tetramerización correcta de la NA también podría contribuir a corregir el plegado y la función NA 10. Secuencias y vectores de baculovirus de transferencia de albergar dominios de trimerización o tetramerización pueden solicitarse a los autores o de otros laboratorios en el campo, 9,10,12.
Otra cuestión importante para la expresión de proteínas secretadas en células de insecto es la elección de la línea celular de la derecha. Mientras Spodoptera frugiperda deriva células Sf9 soportan la replicación de baculovirus muy bien y se utilizan generalmente para el rescate y la propagación del virus, que tienen una capacidad de secretar grandes cantidades de proteína limitado. Trichoplusia ni deriva BTI-TN-5B1-4 células (comúnmente conocidos como High Five) tener una capacidad mayor secreción y son la línea celular de elección para la expresión en este protocolo 13,14. Además, es útil para reducir o incluso eliminar el suero bovino fetal (FBS) a partir de cultivos de expresión. Por lo tanto, utilizamos los medios de comunicación con reducida (3%) Contenido de FBS para el crecimiento de las reservas de trabajo de virus, y llevamos a cabo la expresión de proteínas en medio libre de suero.
Proteínas HA y NA recombinantes se utilizan para muchas técnicas inmunológicas. Tal vez la más común se encuentra en ensayos de ELISA para medir la seroconversión tras la vacunación en humanos o animales 4,6,7,15. HAs y NAS también se utilizan en ensayos de ELISPOT como ambas moléculas estimuladoras y reactivos de detección de células secretoras de anticuerpos 16. Su uso como cebos moleculares permite ordenar específicamente para plasmablasts u otros tipos de células B, que luego se pueden utilizar para aislar anticuerpos monoclonales (terapéuticos) (mAbs). Recombinantes HA y NA moléculas son más utilizados en la caracterización de estos mAb 8. Otros ejemplos incluyen el estudio de la estabilidad del pH o de la especificidad del receptor de ha expresado por diferentes cepas de virus, o cuantitativamente evaluar enzimática específica NAla actividad o la resistencia a los inhibidores. Además, recombinante, purificada de HA se puede utilizar para normalizar el contenido de HA de las vacunas de virus de la gripe inactivados.
Es importante destacar que rHA (y hasta cierto punto NA) vacunas candidatas están actualmente en evaluación en modelos animales y ensayos clínicos en humanos con una vacuna candidata está autorizada por la FDA en 2013 2,17-19. La ventaja de estas nuevas vacunas es que, debido a la naturaleza recombinante de estas proteínas, el proceso de trabajo intensivo de generación de virus de genomas reordenados de alto crecimiento podría ser evitado. Quizás aún más importante es el hecho de que su rendimiento HA es alta y reproducible de cepa a cepa. También, ya que estas vacunas se producen en un sistema libre de huevo, que no contienen contaminantes proteicos que son problemáticos para individuos con alergia al huevo.
Aquí hemos elegido para expresar las proteínas HA y NA de dos aislamientos del nuevo virus de influenza H7N9 Chino, A / Anhui/1/13 y A/Shanghai/1/13 20,21. Estos son ejemplos oportunos, pero el protocolo descrito se pueden utilizar para la expresión de cualquier gripe A y B proteínas HA o NA y se pueden adaptar para expresar cualquier otras proteínas virales o celulares secretadas. Proteínas transmembrana trimérica o tetraméricas pueden ser clonados en los casetes de expresión utilizados para la HA y NA, respectivamente. Sin embargo, las proteínas celulares secretadas más solubles, como los interferones, por ejemplo, no es necesario un dominio adicional para la estabilización y se pueden expresar únicamente con una etiqueta de hexahistidina C-terminal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la expresión de virus de la gripe HA y NA proteínas en células de insecto utilizando el sistema de expresión de baculovirus es generalmente sencillo, hay varios puntos importantes a considerar. Es importante, como se ha señalado en la introducción, que los ectodominios de HA y NA se expresan en fusión con dominios de trimerización o tetramerización, respectivamente. Estos dominios garantizar el correcto plegado de las moléculas normalmente ayudado por el dominio de transmembrana, que no está presente s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Patrick C. Wilson para CR9114 anticuerpo monoclonal. También agradecemos a Jennifer Debeauchamp y Richard Webby para los plásmidos originales A/Anhui/1/13. Soporte parcial para este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas-financiado Proyecto Programa de Subvención AI097092-01A1 y CEIRS (Centros de Excelencia para la Investigación de la Influenza y Vigilancia, HHSN26620070010C). FK fue apoyado por una beca de Erwin Schrödinger (3232 J) del Fondo de Ciencias de Austria (FMF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
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