Hier beschrijven we een manier om correct gevouwen en functionele oppervlak influenzavirus-antigenen afgeleid van de nieuwe Chinese H7N9 virus in insectencellen uiten. De techniek kan worden aangepast aan ectodomeinen van elke virale of cellulaire oppervlakte-eiwitten tot expressie.
Het baculovirus expressiesysteem is een krachtig hulpmiddel voor expressie van recombinante eiwitten. Hier gebruiken we het om correct gevouwen en geglycosyleerd versies van het influenza A-virus oppervlakte glycoproteïnen produceren – het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA). Als voorbeeld, we kozen voor de HA en NA eiwitten door het nieuwe H7N9 virus dat onlangs naar voren gekomen in China uitgedrukt. Maar het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor HA en NA eiwitten op andere influenza A en B virusstammen uitgedrukt. Recombinant HA (rHA) en NA (RNA) eiwitten zijn belangrijke reagentia voor immunologische testen zoals ELISPOT en ELISA, en zijn ook veel gebruikt voor vaccin standaardisatie, antilichaam ontdekking, isolatie en karakterisering. Bovendien kunnen recombinante NA moleculen worden gebruikt om te screenen op kleine moleculen remmers en zijn nuttig voor het karakteriseren van de enzymatische functie van de NA, en de gevoeligheid voor antivirale middelen. Recombinante HA-eiwitten zijn ook being getest experimentele vaccins in diermodellen, en een vaccin op basis van recombinant HA werd onlangs erkend door de FDA voor gebruik bij mensen. Werkwijze beschrijven we hier om de moleculen is eenvoudig en kan onderzoek naar influenza-laboratoria, aangezien het voor de productie van grote hoeveelheden eiwitten snel en tegen lage kosten. Hoewel hier richten we ons op influenzavirus oppervlakte glycoproteïnen kan deze werkwijze ook worden gebruikt om andere virale en cellulaire oppervlakte-eiwitten.
Als eerste reactie op de recente opkomst van nieuwe H7N9 influenza-virusstam in China, verwierven wij plasmiden die de genomische sequenties voor de hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) genen van de eerste twee isolaten. Met deze plasmiden konden we snel bouwen baculovirus expressievectoren voor de productie van recombinant HA en NA in insectencellen. Deze uitdrukking systeem goed is ingeburgerd in ons laboratorium en is van cruciaal belang voor veel van onze lopende onderzoeksprojecten 1-8 bewezen. Insect cellen in staat zijn te kunnen vouwen en post-translationeel complexe eiwitten te wijzigen. Deze modificaties omvatten N-gebonden glycosylering, wat belangrijk is voor veel virale glycoproteïnen. Als zodanig is het niet verwonderlijk dat de baculovirussysteem vrij is opgericht voor het uiten van influenzavirus oppervlakte-antigenen. In feite zijn veel van de HA en NA kristalstructuren zijn opgelost middels insectencel tot expressie gebrachte eiwitten 9-11. Een ander voordeel van desysteem is de betrouwbare eiwitrijk opbrengsten van maximaal 30 mg HA / L cellen (gebaseerd op onze ervaring met meer dan 50 verschillende eiwitten HA) – gevolg van virus-infectie aangedreven expressie van de sterke polyhedrine promoter.
Verwijdering van het transmembraan en endodomein van het HA en NA eiwitten maakt expressie van uit te scheiden, oplosbare versies van de eiwitten en daarmee aanzienlijk vergemakkelijkt het zuiveringsproces. Bovendien zijn deze ectodomeinen hexahistidine gelabeld en derhalve worden gezuiverd middels affiniteitschromatografie met Ni2 +-hars. De transmembraandomeinen van HA en NA eiwitten dragen respectievelijk homotrimeer en homotetrameer formatie. Om deze oligomerisaties behouden, voegen we een C-terminaal domein trimerisatie de HA-en een N-terminale tetramerisatie domein aan de NA constructen (figuur 1). We hebben onomstotelijk aangetoond dat een dergelijke trimerisatie domein stabiliseert functionele, gevolgenGraco behoudt conformationele epitopen op de stengel-domein van de HA 1. De juiste tetramerisatie van de NA kan ook bijdragen aan vouwen en NA functie 10 corrigeren. Sequenties en baculo-overdracht vectoren herbergen trimerisatie of tetramerisatie domeinen kunnen worden opgevraagd bij de auteurs of van andere laboratoria in het veld, 9,10,12.
Een ander belangrijk punt voor expressie van uitgescheiden eiwitten in insectencellen is de keuze van de juiste cellijn. Terwijl Spodopterafrugiperda afgeleid Sf9 cellen ondersteunen baculovirus replicatie heel goed en worden meestal gebruikt voor virus rescue en vermeerdering, hebben zij beperkte capaciteit om grote hoeveelheden eiwit uitscheiden. Trichoplusia ni afgeleid BTI-TN-5B1-4 cellen (algemeen bekend als High Five) hebben een hogere uitscheiding capaciteit en zijn de cellijn van de keuze voor expressie in dit protocol 13,14. Voorts is het nuttig te verminderen of zelfs te verwijderen foetaal runderserum (FBS) van expressie culturen. We gebruiken ook media met verminderde (3%) FBS inhoud voor het kweken van het virus werkvoorraden en voeren we de eiwitexpressie in serumvrij medium.
Recombinant HA en NA eiwitten worden gebruikt voor vele immunologische technieken. Misschien is de meest voorkomende is in ELISA-testen voor het meten van serum conversie na vaccinatie bij mensen of dieren 4,6,7,15. Heeft en NA worden ook gebruikt in ELISPOT testen zowel stimulerende moleculen en detectie reagentia voor antilichamen uitscheidende cellen 16. Het gebruik als moleculaire lokaas kan specifiek sorteren voor plasmablasten of andere soorten B-cellen die vervolgens kunnen worden gebruikt om (therapeutische) monoklonale antilichamen (mAbs) te isoleren. Recombinant HA en NA moleculen worden verder gebruikt voor de karakterisatie van deze mAbs 8. Andere voorbeelden zijn de studie van de pH-stabiliteit of receptor specificiteit van HAS door verschillende virus isolaten vertoonden, of kwantitatief beoordelen van specifieke NA enzymatischeactiviteit of resistentie tegen remmers. Verder recombinant gezuiverd HA kan worden om HA-gehalte van geïnactiveerd influenzavirus vaccin standaardiseren.
Belangrijk, rHA (en tot op zekere hoogte NA) kandidaat-vaccins worden momenteel getest in diermodellen en klinische proeven op mensen met een kandidaat-vaccin wordt in licentie gegeven door de FDA in 2013 2,17-19. Het voordeel van deze nieuwe vaccins is dat door de recombinante aard van deze eiwitten, het arbeidsintensieve proces van produceren van hoge groei reassortante virussen kunnen worden vermeden. Misschien nog belangrijker is het feit dat de HA rendement is hoog en reproduceerbaar van stam tot stam. Ook, omdat deze vaccins worden geproduceerd in een ei-vrij systeem, ze niet eiwitverontreinigingen die problematisch zijn voor mensen met een ei-allergie bevatten.
Hier kozen we voor de HA en NA eiwitten tot expressie van twee isolaten van de nieuwe Chinese H7N9 griepvirus, A / Anhui/1/13 en A/Shanghai/1/13 20,21. Dit zijn geschikte voorbeelden, maar de beschreven protocol kan worden toegepast voor expressie van een influenza A en B HA en NA eiwitten en kunnen worden aangepast aan andere uitgescheiden virale of cellulaire eiwitten tot expressie. Trimere of tetramere transmembraan eiwitten kunnen worden gekloneerd in de expressiecassettes voor HA en NA, respectievelijk. Echter, de meeste oplosbare uitgescheiden cellulaire eiwitten, zoals interferonen bijvoorbeeld geen extra domein voor stabilisatie nodig en kan alleen worden uitgedrukt met een C-terminale hexahistidine tag.
Hoewel expressie van influenzavirus HA en NA eiwitten in insectencellen met het baculovirus expressiesysteem het algemeen ongecompliceerd, er een aantal belangrijke punten om te overwegen. Het is belangrijk, zoals in de inleiding, dat de ectodomeinen van HA en NA worden uitgedrukt in fusie met trimerisatie of tetramerisatie domeinen, respectievelijk. Deze domeinen correcte vouwing van de moleculen begeleid vanuit het transmembraandomein, die niet voorkomen als alleen het ectodomein uitgedrukt. Bijvoorbeeld, de expressie…
The authors have nothing to disclose.
Wij willen Patrick C. Wilson bedanken voor monoklonaal antilichaam CR9114. We danken ook Jennifer Debeauchamp en Richard Webby voor de originele A/Anhui/1/13 plasmiden. Gedeeltelijke ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten gefinancierd programma Project Grant AI097092-01A1 en CEIRS (Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance, HHSN26620070010C). FK werd ondersteund door een Erwin Schrödinger fellowship (J 3232) van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
High Five cells | Invitrogen | B85502 |