배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현
Summary
여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.
Abstract
배큘로 바이러스 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을위한 강력한 도구이다. 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 아제 (NA) – 여기서 우리는 독감의 제대로 접어 당화 버전의 바이러스 표면 당 단백질을 생산하기 위해 사용합니다. 예를 들어, 우리는 최근 중국에서 출현 한 새로운 H7N9 바이러스에 의해 표현 된 HA 및 NA 단백질을 선택했다. 그러나 프로토콜은 쉽게 다른 인플루엔자 및 B 바이러스 균주에 의해 발현 HA 및 NA 단백질을 위해 적응 될 수있다. 재조합 HA (RHA)와 NA (RNA) 단백질은 ELISPOT 및 ELISA와 같은 면역 학적 분석을위한 중요한 시약, 그리고 백신 표준화, 항체 발견, 분리 및 특성 분석을위한 다양한 프로그램도 사용합니다. 또한, 재조합 NA 분자는 작은 분자 억제제에 대한 화면으로 사용하고 NA의 효소 기능의 특성뿐만 아니라, 항 바이러스제에 대한 민감도에 유용하다 할 수있다. 재조합 HA 단백질은 또한 바이 아르NG는 동물 모델에서 실험적인 백신으로, 테스트 및 재조합 HA 기반의 백신은 최근에 인간에 사용하기 위해 FDA에 의해 허가했다. 그것은 빠르고 저렴한 비용으로 단백질의 대량 생산이 가능하기 때문에 우리는이 분자를 생산하기 위해 여기에 설명하는 방법은, 곧장 앞으로 인플루엔자 실험실에서 연구를 촉진 할 수 있습니다. 우리는 인플루엔자 바이러스의 표면 당 단백질에 초점 여기 있지만,이 방법은 또한 다른 바이러스 및 세포 표면 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다.
Introduction
중국에서 새로운 H7N9 인플루엔자 바이러스 균주의 최근 출현에 첫 번째 응답으로, 우리는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)의 처음 두 균주의 유전자에 대한 게놈 서열을 운반하는 플라스미드를 취득했다. 우리는 신속하게 곤충 세포에서 재조합 HA와 NA의 생산 배큘로 바이러스 발현 벡터를 구축 할 수 있었다 이러한 플라스미드를 사용하여. 이 발현 시스템은 잘 실험실에 설립되어 지속적인 연구 프로젝트 1-8의 많은 중요한 입증되었습니다. 곤충 세포는 올바르게 접혀 사후 병진 복합 단백질을 수정할 수있다. 이러한 수정은 많은 바이러스 당 단백질에 중요한 N-결합 글리코 실화를 포함한다. 따라서, 그것은 배큘로 바이러스 시스템이 꽤 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현하는 확립되는 것은 놀라운 일이 아니다. 사실, HA 및 NA 결정 구조의 많은 곤충 세포 발현 된 단백질을 사용하여 9-11 해결되었다. 또 다른 장점강한 폴리 헤드린 프로모터로부터 바이러스 감염 구동 식의 결과 – 시스템 (50 개 이상의 서로 다른 HA 단백질과 우리의 경험을 바탕으로) HA / L 세포 배양의 최대 30 밀리그램의 신뢰성 높은 단백질 수율에 자리 잡고 있습니다.
HA 및 NA 단백질의 막 횡단 및 endodomain 제거하여 단백질 secretable, 수용성 버전의 발현을 허용하고 따라서 크게 정제 공정을 용이하게한다. 또, 이러한 ectodomains는 hexahistidine 태그 된 따라서 니켈 2 +-수지를 사용하여 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다. HA 및 NA 단백질의 막 관통 도메인은 각각 homotrimer 및 homotetramer 형성에 기여한다. 이러한 oligomerizations을 유지하기 위해, 우리는 HA-, 및 NA에 N-말단 테트라 도메인 (그림 1) 생성에 C-말단 삼량 도메인을 추가합니다. 우리는 삼량 도메인 기능,하고 당연한를 안정 결론적으로 보여 주었다HA 1의 줄기 영역에 구조적 에피토프를 rved. NA의 올바른 테트라는 접는 및 NA 기능 10를 해결하는 데 기여할 수 있습니다. 삼량 또는 테트라 도메인을 품고 시퀀스와 baculo 전송 벡터는 저자 또는 필드, 9,10,12의 다른 실험실에서 요청하실 수 있습니다.
곤충 세포에서 분비되는 단백질의 발현을위한 또 다른 중요한 문제는 바로 세포주의 선택입니다. 스포 도프 테라 프 루기 페르가 인 Sf9 세포가 잘 배큘로 바이러스 복제를 지원하고 일반적으로 바이러스 구조 및 증식을 위해 사용되는 파생 동안, 단백질의 다량 분비하는 능력을 제한 하였다. Trichoplusia NI는 (일반적으로 하이 파이브로 알려진) BTI-TN-5B1-4 세포 유래 높은 분비 능력을 가지고 있고이 프로토콜 13, 14의 발현에 대한 선택의 세포주이다. 또한,이 소 태아 혈청을 감소 또는 제거하는 것이 도움이된다 (FB표현 문화의 S). 따라서 우리는 바이러스 일 주식을 성장에 대한 감소 (3 %) FBS 콘텐츠와 미디어를 사용하여, 우리는 혈청이없는 배지에서 단백질 발현을 수행합니다.
재조합 HA 및 NA 단백질은 많은 면역 학적 기술에 사용된다. 아마도 가장 일반적인 것은 사람이나 동물에 접종 4,6,7,15에 혈청 전환을 측정하기위한 ELISA 분석법이다. 가 및 NAS는 항체를 분비하는 세포 (16)에 대한 자극 분자 검출 시약 모두로 ELISPOT 분석 실험에 사용됩니다. 분자 미끼로서의 용도는 특별히 plasmablasts 또는 후 (치료) 단일 클론 항체 (모노클로 날 항체)를 분리하기 위해 사용될 수 B-세포의 다른 유형에 대해 정렬 할 수있다. 재조합 HA 및 NA 분자는 더 이상 이러한 단클론 항체 (8)의 특성 분석에 사용됩니다. 다른 예로는 pH가 안정 또는 수용체 특이성 다른 바이러스 균주에 의해 표명의, 또는 정량적으로 평가하는 특정 NA의 효소를 연구 포함억제제 활동이나 저항. 또한, 재조합, 정제 된 HA는 불 활성화 인플루엔자 바이러스 백신의 HA 함량을 표준화하기 위해 사용될 수있다.
중요한 것은, RHA (그리고 어느 정도 NA) 백신 후보는 현재 하나의 백신 후보 2013 2,17-19에 FDA에 의해 허가 된 상태 동물 모델과 인간의 임상 실험으로 테스트되고있다. 이러한 신규 한 백신의 장점으로 인해 이들 단백질의 재조합 특성으로 높은 성장 재조합 바이러스의 생성의 노동 집약적 공정이 회피 될 수 있다는 것이다. 아마도 더욱 중요한 자신의 HA의 수율이 높고 변형의 변형을 재현 할 수 있다는 사실입니다. 이 백신은 계란이없는 시스템에서 생산되기 때문에 또한, 그들은 계란 알레르기가있는 개인에 대한 문제가있다 단백질 오염 물질을 포함하지 않습니다.
여기서 우리는 새로운 중국어 H7N9 인플루엔자 바이러스, A / ANH의 두 균주에서 HA와 NA 단백질을 표현하기 위해 선택ui/1/13 및 A/Shanghai/1/13 (20, 21). 이들은 적시 예이지만 설명한 프로토콜은 임의의 인플루엔자 A와 B HA 또는 NA 단백질의 발현을 위해 사용할 수있는 다른 어떤 분비 된 바이러스 또는 세포 단백질을 표현하도록 할 수있다. 삼량 체 또는 사량 막 횡단 단백질은 각각, HA 및 NA에 사용되는 발현 카세트로 클로닝 될 수있다. 그러나, 대부분의 수용성 분비 세포 단백질은, 예를 들어 인터페론 같은 안정화를위한 추가 도메인을 필요로하지 않고, C-말단 hexahistidine 태그 전적으로 표현 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 곤충 세포에서 인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 발현이 곧장 앞으로 일반적이지만, 고려해야 할 여러 가지 중요한 점이있다. 서론에서 지적한 것처럼 그것은 HA와 NA의 ectodomains이 각각 삼량 또는 테트라 도메인과의 융합으로 표현되는, 중요합니다. 이 도메인은 일반적 ectodomain 표현하면 존재하지 않는 횡단 도메인의 도움으로 분자의 정확한 폴?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 단일 클론 항체 CR9114 패트릭 C. 윌슨에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 원래 A/Anhui/1/13 플라스미드에 제니퍼 Debeauchamp 리처드 웨비 감사합니다. 이 작품에 대한 부분 지원은 알레르기에 대한 국립 연구소에 의해 제공되고 전염성 프로그램 프로젝트 부여 AI097092-01A1와 CEIRS (인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 센터 HHSN26620070010C) 질병 – 투자되었다. FK는 오스트리아 과학 기금 (FWF)에서 어윈 슈뢰딩거의 교제 (J 3232)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
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