JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Published: October 27, 2013
doi:
10.3791/51055
, , ,
1Institute of Microbiology,University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal kokültürü seçici gibi amip ve makrofajlar gibi fagositik hücrelere karşı mümkün hücre içi patojenleri büyümesi yapışık amipler kullanarak bir hücre kültür sistemi. Bu yüzden, yeni enfeksiyöz ajanlar keşfetmek için önemli bir aracı temsil eder. Amoebal zenginleştirme amoebal yeni türlerin ve bunların özel hücre içi bakteri keşfini sağlar.

Abstract

Bu tür Legionella, mikobakteriler ve Chlamydia benzeri organizmalar olarak hücre içi patojenler genellikle tüm genellikle bakteri yetiştirmek için kullanılan seçici ortam üzerinde zayıf ya da büyür, çünkü izole etmek zordur. Bu nedenle, bu patojenlerin çoğu sadece son zamanlarda keşfedilen veya önemli salgınlar takip edildi. Bu patojenler genellikle konakçı hücre olarak görev yapar ve bakterilerin hayatta kalması ve büyümesi sağlayan amip ile ilişkilidir. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme: Biz klinik veya çevre örneklerinde hücre içi patojenlerin izolasyonu ve karakterizasyonu mevcut izin iki teknik bir gösteri sunmak için buradayız niyetinde. Amoebal kokültürü numunede mevcut olan hücre içi bakteri tarafından enfekte edilmiş ve lize edilebilir bir amoebal çim üzerine aşılanması ile incelenen örnek, hücre içi bakterilerin iyileşme sağlar. Amoebal zenginleştirme klinik ya da çevresel örneklemde amip kurtarma mevcut sağlar. Thama aynı zamanda bu amip özellikle büyüyen yeni hücre içi bakteri yeni amoebal türlerin keşfine yol açabilir edilir. Birlikte, bu iki teknik amip büyümek mümkün yeni hücre içi bakteri keşfetmek için yardımcı olur. Çünkü amipler enfekte ve fagositoz karşı yetenekleri nedeniyle, bu hücre içi bakteri da makrofajlar tarafından fagositoz kaçış olabilir ve bu nedenle, daha yüksek ökaryotlar için patojenik.

Introduction

Moleküler tanı gelişiyle önce, çevre nişler ya da klinik örneklerde mevcut mikroorganizmalar genellikle ağırlıklı Petri yemekleri ağar üzerinde, farklı seçici medya yetiştirilmesi tarafından tespit edildi. Bakteri kolonileri ve bunların metabolik aktivite fenotip daha sonra türler düzeyinde bakteri sınıflandırma izin verdi. Et suyu, aynı zamanda algılama hassasiyeti arttırmak için kullanılabilmektedir. Ancak, her iki teknik de bu ortama yavaş ya da büyür bakterilerin kurtarma izin yoktur. Bu moleküler yaklaşımlar çok yaygın günümüzde kullanılan nedeni budur. Bununla birlikte, DNA tespiti bakterilerin canlılığı üzerindeki herhangi bir ipucu sağlar. Ayrıca, aksine kültüre, moleküler yaklaşımlar daha fazla karakterize edilebilir bir suş içerisinde sonuçlanmaz.

Büyümeye katı ortam ya da ihtiyaç hücreleri üzerinde zayıf büyüyecek patojenlerin incelenmesi karmaşıktır. Bunların çoğu bakteriler titiz intr olan "zor büyümek"aselüler bakteriler, genellikle keşfedilen ve Legionella pneumophila için olduğu gibi büyük salgınlar sonrasında karakterizedir. Bu bakteri bir Amerikan Lejyonu kongre sırasında meydana gelen bir salgın aşağıdaki karakterize edildi. Birçok 182 olarak kişi enfekte ve 29 nedeniyle ağır pnömoni 1,2 ölmüştür. Daha sonra amip doğal bu bakterinin ana ve otel klima sistemi ve su şebekelerinde onların varlığı sözde Lejyoner hastalığının 3 salgının kökeni olduğunu olduğu gösterilmiştir.

Amipler dünya çapında bulunur ve toprak, hava, su ve (4 gözden), insan gönüllülerin burun mukozasından izole edilmiştir. Bu "serbest yaşayan" Amiblerden genellikle ortamında özerk bölünmesi ama bazen müsamahakar ana 5. istila edebilir. Hy tarafından fagositoz ve sonraki lizozomal sindirim yoluyla çeşitli mikroorganizmalar üzerinde Amip beslemedrolases 6. Birçok fakültatif veya zorunlu hücre içi bakteri sindirim direnmek ve böylece bulaştırmak ve örnek Legionella, Chlamydia ilişkili bakteriler veya mikobakteriler gibi amip bölmek (7 gözden ve 8) edebiliyoruz. Serbest yaşayan amipler olasılıkla henüz keşfedilmiş değil hücre içi bakteriler için önemli bir potansiyel rezervuar temsil eder. Bu Lozan'da farklı gruplar çeşitli çevresel örneklerde 9-15 birkaç yeni zorunlu hücre içi mikroorganizmaları izole etmek için izin amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme denilen iki ana tekniklerini uygulamak, bizim grup yol açtı.

Amip bakteriler üzerinde otlatma profesyonel fagositlerdir yana, fagositoz direnmek ve bu protistler içinde büyümek mümkün bir bakteri aynı zamanda insan fagositler kolonize ve insanlara karşı patojenik olabilir. Bu, kısmen, Waddlia CHO gibi bir Chlamydia ile ilgili bakteriler için gösterilmiştirndrophila. W. chondrophila amip değil, aynı zamanda örneğin memeli epitel hücreleri, makrofajlar ve balık hücre hatları 16-18 gibi çeşitli hücre tiplerinde, sadece büyüyebilir. Amoebal kokültürü da ağır farklı bakteri türlerinin 21 ile kontamine dışkı gibi klinik örneklerde 19,20, hücre içi bakterilerin saptanması için ilgili görünür.

Aksenik ortam üzerinde amip (b) büyüme ve Escherichia coli bakteriyel çim ve (c) seçimi ve karakterizasyonu; Burada çevresel veya klinik örneklerin (a) tedavisi dahil olmak üzere, ortak kültürü amoebal ve amoebal zenginleştirme en önemli adımları açıklar hücre içi bakteri.

Protocol

1.. Amoebal Coculture 1.1 Numune hazırlama Çevre örnek Su örnekleri 0.22 mikron gözenek boyutlu zar boyunca su örnek (1 L için 500 mi) filtre. Sonra, (Page'in amip tuzlu orta PAS zarı sallamak NaCl 120 mg, MgSO 4 4 mg • 7H 2 O, CaCl 2 4 mg • 2H 2 O, Na 2 HPO 4 142 mg, ve KH 136 mg damıtılmış su, 1 L 2 PO 4). …

Representative Results

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme kullanarak, çevresel ve / veya patojenik bakterilerin bir dizi (Tablo 1) keşfedildi. Amoebal kokültürü çevre örnekleri, su arıtma tesisleri ve su dağıtım sistemleri analiz etmek bizim grup ve başkaları tarafından kullanılmıştır. Mikroorganizmaların geniş bir yelpazede bu teknik ile izole edilebilir. Amoebal kokültür izole en yaygın bakteri su arıtma tesislerinden ve su şebekeleri 13,14,24,27,28</su…

Discussion

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme birçok yeni bakteriyel ve amoebal türlerin izole izin etkili yöntemlerdir. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar amip ve ortamda amip dirençli bakterilerin hem her yerde varlığını doğrulamak, ve en ilginci böyle klorlama ve ozonlama gibi kimyasal tedaviler ile kontrol olarak kabul edilir sentetik su şebekelerinde. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme yalıtmak ve yetiştirmek bu potansiyel patojen mikroorganizmalar ve daha sonra da biyoloji ve patog…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Pr teşekkür ederim. Yardımcı teknik tavsiye ve amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme üzerine ilginç bir tartışma için Bernard La Scola. Biz de bizim laboratuvarda tekniği uygulayarak yaptığı yardım için Dr Vincent Thomas teşekkür ederim.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Intracellular PathogensLegionellaMycobacteriaChlamydia-like OrganismsAmoebaeAmoebal CocultureAmoebal EnrichmentIsolationCharacterizationClinical SamplesEnvironmental SamplesBacterial GrowthPhagocytosisMacrophagesPathogenic

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image