Summary

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Published: October 27, 2013
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Summary

Cocultivo de amebas es un sistema de cultivo celular usando amebas adherente a crecer selectivamente a los patógenos intracelulares capaces de resistir las células fagocíticas tales como amebas y macrófagos. Por lo tanto, representa una herramienta clave para descubrir nuevos agentes infecciosos. Enriquecimiento amebas permite el descubrimiento de nuevas especies de amebas y de sus bacterias intracelulares específicos.

Abstract

Los patógenos intracelulares tales como legionella, micobacterias y organismos Chlamydia como son difíciles de aislar porque a menudo crecen poco o nada en absoluto en un medio selectivo que por lo general se utilizan para cultivar bacterias. Por esta razón, muchos de estos patógenos fueron descubiertas sólo recientemente o después de los brotes importantes. Estos patógenos se asocian a menudo con las amebas, que sirven como la célula huésped y permitir la supervivencia y el crecimiento de las bacterias. Pretendemos aquí para proporcionar una demostración de dos técnicas que permiten el aislamiento y caracterización de patógenos intracelulares presentes en muestras clínicas o ambientales: el co-cultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas. Cocultivo de amebas permite la recuperación de bacterias intracelulares mediante la inoculación de la muestra investigada en un césped de amebas que puede ser infectado y se lisaron por las bacterias intracelulares presentes en la muestra. Enriquecimiento de amebas permite la recuperación de las amebas presente en una muestra clínica o ambiental. Thse puede conducir al descubrimiento de nuevas especies de amebas, pero también de nuevas bacterias intracelulares que crecen específicamente en estas amebas. Juntas, estas dos técnicas ayudan a descubrir nuevas bacterias intracelulares capaces de crecer en las amebas. Debido a su capacidad para infectar las amebas y resistir la fagocitosis, estas bacterias intracelulares también pueden escapar de la fagocitosis por los macrófagos y, por tanto, ser patógenos para los eucariotas superiores.

Introduction

Antes de la llegada del diagnóstico molecular, los microorganismos presentes en los nichos ambientales o en las muestras clínicas se detectan generalmente mediante su cultivo en diferentes medios selectivos, principalmente en agar en placas de Petri. El fenotipo de las colonias bacterianas y su actividad metabólica después se dejó clasificación bacteriana a nivel de especies. Caldo también puede utilizarse para aumentar la sensibilidad de detección. Sin embargo, ambas técnicas no permiten la recuperación de bacterias que crecen lentamente o en absoluto en estos medios. Esta es la razón por qué los enfoques moleculares se usan tan ampliamente hoy en día. Sin embargo, la detección de ADN no proporciona ninguna pista sobre la viabilidad de las bacterias. Por otra parte, contrariamente a la cultura, enfoques moleculares no dan lugar a una cepa que puede caracterizarse adicionalmente.

El estudio de los patógenos que crecen pobremente en medios sólidos o que las células necesitan para crecer es complicado. La mayoría de estos "difíciles de cultivar" las bacterias son intr fastidiosobacterias acelulares, a menudo descubiertas y caracterizadas siguiente brotes grandes como lo fue el caso de la Legionella pneumophila. Esta bacteria se caracterizó después de un brote que se produjo durante una convención de la Legión Americana. Nada menos que 182 personas fueron infectadas y 29 murieron a causa de una neumonía grave 1,2. Se demostró más tarde que las amebas son los huéspedes naturales de esta bacteria y que su presencia en las redes hotel de sistemas de aire acondicionado y el agua estaba en el origen del brote de la enfermedad de la llamada del legionario 3.

Las amebas están presentes en todo el mundo y fueron aisladas de suelo, el aire, el agua y la mucosa nasal de voluntarios humanos (revisado en 4). Estas amebas "vida libre" generalmente se divide de forma autónoma en el medio ambiente, pero en ocasiones puede invadir anfitriones permisivas 5. Las amebas de alimentación en varios microorganismos a través de la fagocitosis y la posterior digestión lisosomal por Hydrolases 6. Muchas bacterias intracelulares facultativas o obligar son capaces de resistir la digestión y así infectar y dividir en amebas como por ejemplo bacterias o micobacterias relacionadas con clamidia Legionella, (revisado en 7 y 8). Amebas de vida libre, probablemente, representan un importante reservorio potencial de bacterias intracelulares que aún no han sido descubiertos. Esto llevó a nuestro grupo para implementar en Lausana dos técnicas principales, llamados co-cultivo de amebas amebas y enriquecimiento, lo que permitió los diferentes grupos para aislar varios nuevos microorganismos intracelulares obligados de diversas muestras ambientales 9-15.

Desde amebas son fagocitos profesionales que pastan en las bacterias, una bacteria capaz de resistir la fagocitosis y de crecer dentro de estos protistas también puede colonizar los fagocitos humanos y ser patógeno para los seres humanos. Esto fue parcialmente demostrada por algunas bacterias relacionadas con la clamidia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila puede crecer no sólo en las amebas, sino también en varios tipos de células, tales como células de mamífero epiteliales, macrófagos, y las líneas celulares de peces 16-18. El cocultivo de amebas también aparece relevante para la detección de bacterias intracelulares en muestras clínicas 19,20, incluyendo las heces, que están fuertemente contaminados con diferentes especies bacterianas 21.

Aquí se describen los pasos principales de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, incluyendo (a) el tratamiento de muestras ambientales o clínicos; (b) el crecimiento de las amebas en medios axénicos y en un césped bacteriano de Escherichia coli y (c) la selección y caracterización de bacterias intracelulares.

Protocol

1. Amebas Coculture 1.1 Preparación de la muestra Muestra Ambiental Las muestras de agua Se filtra la muestra de agua (500 ml a 1 L) a través de una membrana de tamaño de poro 0,22 micras. Luego, sacuda la membrana en solución salina ameba medianas PAS de Página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, y 136 mg de K…

Representative Results

Uso de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, toda una gama de bacterias del medio ambiente y / o patógenos se descubrió (Tabla 1). Cocultivo amebas fue utilizado por nuestro grupo y otros para analizar las muestras ambientales, plantas de tratamiento de agua y sistemas de distribución de agua. Una amplia gama de microorganismos puede ser aislado con esta técnica. Las bacterias más comunes aisladas por cocultivo amebas son miembros del género Mycobacte…

Discussion

Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son métodos eficientes que permitieron el aislamiento de muchas nuevas especies de bacterias y amebas. Los resultados obtenidos con estos métodos confirman la presencia ubicua de los dos amebas y bacterias ameba-resistencia en el medio ambiente, y lo más interesante de las redes de agua artificiales que se consideran para ser controlada por tratamientos químicos tales como cloración y ozonización. Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son herramientas esenciales para a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Pr. Bernard La Scola para consejos técnicos útiles y discusión interesante sobre el co-cultivo de amebas y enriquecimiento de amebas. También agradecemos a la Dra. Vincent Thomas por su ayuda en la implementación de la técnica en nuestro laboratorio.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

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Cite This Article
Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

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