Summary

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Published: October 27, 2013
doi:

Summary

Amöben Kokultur ein Zellkultursystem mit adhärenten Amöben, selektiv wachsen intrazelluläre Pathogene in der Lage, phagozytische Zellen wie Amöben und Makrophagen zu widerstehen. Es stellt somit ein wichtiges Instrument, um neue Infektionserreger entdecken. Amöben Bereicherung ermöglicht Entdeckung neuer Amöbenarten und ihrer spezifischen intrazellulären Bakterien.

Abstract

Die intrazelluläre Erreger wie Legionellen, Mykobakterien und Chlamydien-ähnlichen Organismen sind schwierig zu isolieren, weil sie schlecht oder gar nicht wachsen oft überhaupt auf selektiven Medien, die üblicherweise verwendet werden, um Bakterien zu kultivieren. Aus diesem Grund sind viele dieser Krankheitserreger wurden erst vor kurzem oder folgenden wichtigen Ausbrüche entdeckt. Diese Erreger sind oft mit Amöben, die als Wirtszelle dienen und ermöglichen es, das Überleben und das Wachstum der Bakterien verbunden. Wir wollen hier, um eine Demonstration von zwei Techniken, die Isolierung und Charakterisierung von intrazellulären Erregern in der klinischen oder Umweltproben vorhanden ermöglichen bieten: die Amöben Co-Kultur und die Amöben Bereicherung. Amöben Co-Kultur ermöglicht die Wiederherstellung der intrazellulären Bakterien, die durch Impfen der untersuchten Probe auf einem Rasen, der Amöben infiziert werden können und lysiert durch die in der Probe vorhanden sind intrazelluläre Bakterien. Amöben Anreicherung ermöglicht die Wiederherstellung von Amöben in einer klinischen oder Umweltprobe vorhanden. Thwird, kann auf Entdeckung von neuen Amöbenarten, sondern auch von neuen intrazellulären Bakterien wachsen speziell in diesen Amöben führen. Zusammen helfen diese beiden Techniken, um neue intrazelluläre Bakterien in der Lage, in Amöben wachsen zu entdecken. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Amöben infizieren und wider Phagozytose, intrazelluläre Bakterien könnten diese auch zu entkommen Phagozytose durch Makrophagen und somit sein pathogen für höhere Eukaryonten unterschieden.

Introduction

Vor dem Aufkommen der molekularen Diagnostik, wurden in der Umwelt Nischen oder in klinischen Proben vorhandenen Mikroorganismen oft durch Kultivierung auf verschiedenen selektiven Medien, vor allem auf Agar in Petrischalen nachgewiesen. Der Phänotyp der Bakterienkolonien und ihre Stoffwechselaktivität erlaubt dann bakterielle Einstufung auf Artenebene. Brühe kann auch verwendet werden, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Allerdings haben beide Techniken erlauben die Gewinnung von Bakterien, die langsam oder gar nicht auf diesen Medien wachsen. Dies ist der Grund, warum molekulare Ansätze werden so heute weit verbreitet. Dennoch Nachweis von DNA bietet keine Ahnung, auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Darüber hinaus im Gegensatz zu Kultur, Molekularbiologie Ansätze nicht in einem Stamm, der ferner dadurch gekennzeichnet ist, führen.

Studieren Krankheitserreger, die schlecht wachsen auf festen Medien oder dass Bedarf Zellen wachsen ist kompliziert. Die meisten dieser "schwierig zu wachsen" Bakterien sind anspruchsvoll intrazellulären Bakterien, oft entdeckt und folgende große Ausbrüche, wie es der Fall bei Legionella pneumophila war gekennzeichnet. Dieses Bakterium wurde nach einem Ausbruch, die während eines American Legion Convention aufgetreten ist. So viel, wie 182 Menschen wurden infiziert und 29 starben an einer schweren Lungenentzündung 1,2. Es wurde später gezeigt, dass Amöben waren die natürlichen Wirte dieses Bakteriums und dass ihre Anwesenheit im Hotelklimaanlage und Wassernetze war der Ursprung des Ausbruchs der sogenannten Legionärskrankheit 3.

Amöben sind weltweit präsent und wurden aus Boden, Luft, Wasser und die Nasenschleimhaut von Freiwilligen (in 4 Bewertung) isoliert. Diese "freilebenden" Amöben sind in der Regel selbstständig Aufteilung in die Umwelt, sondern kann gelegentlich dringen zügigen Gastgeber fünf. Amöben ernähren sich von verschiedenen Mikroorganismen durch Phagozytose und anschließende lysosomale Verdauung durch hydrolases 6. Viele fakultativ oder obligat intrazelluläre Bakterien sind in der Lage, um die Verdauung zu widerstehen und damit zu infizieren und zu teilen in Amöben wie beispielsweise Legionellen, Chlamydien-verwandten Bakterien oder Mykobakterien (in 7 überprüft und 8). Freilebende Amöben wahrscheinlich eine wichtige potenzielle Reservoir für die intrazelluläre Bakterien, die noch nicht entdeckt wurden. Dies führte unsere Gruppe in Lausanne implementieren zwei Haupttechniken, die so genannte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, die verschiedenen Gruppen zu mehreren neuen obligat intrazelluläre Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben zu isolieren 9-15 erlaubt.

Da Amöben sind professionelle Phagozyten Beweidung auf Bakterien, könnte ein Bakterium in der Lage, die Phagozytose zu widerstehen und innerhalb dieser Protisten wachsen auch kolonisieren menschlichen Phagozyten und sein gegenüber Menschen pathogen. Dies wurde teilweise für einige Chlamydia-verwandten Bakterien, wie gezeigt Waddlia chondrophila. W. chondrophila nicht nur in Amöben, sondern auch in verschiedenen Zelltypen, wie Säuger Epithelzellen, Makrophagen und Fischzelllinien 16-18 wachsen. Die Amöben Kokultur erscheint auch zum Nachweis von intrazellulären Bakterien in klinischen Proben 19,20, darunter Stühle, die stark mit verschiedenen Bakterienarten 21 verunreinigt sind relevant.

Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, einschließlich (a) Behandlung von Umwelt-oder klinischen Proben, (b) das Wachstum von Amöben auf axenischen Medien und auf einem Bakterienrasen von Escherichia coli und (c) der Auswahl und Charakterisierung intrazelluläre Bakterien.

Protocol

1. Amöben Cokultur 1.1 Probenvorbereitung Umweltproben Wasserproben Filtern Sie die Wasserprobe (500 ml auf 1 L) durch einen 0,22 um Porengröße Membran. Dann schütteln Sie die Membran in Pages Amöbe Salzmedium PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO 4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl 2 • 2H 2 O, 142 mg Na 2 HPO 4 und 136 mg KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser). …

Representative Results

Mit Amöben Co-Kultur und Amöben Anreicherung, wurden eine ganze Reihe von Umwelt-und / oder pathogene Bakterien entdeckt (Tabelle 1). Amöben Co-Kultur wurde von unserer Gruppe und andere verwendet werden, um Umweltproben, Wasseraufbereitungsanlagen und Wasserverteilungssystemen zu analysieren. Ein breites Spektrum von Mikroorganismen könnten mit dieser Technik isoliert werden. Die häufigsten Bakterien durch Amöben Co-Kultur isoliert sind Mitglieder der Gattung Myco…

Discussion

Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind effiziente Methoden, die die Trennung von vielen neuen Bakterien-und Amöbenarten erlaubt. Ergebnisse mit diesen Methoden erhaltenen bestätigen die allgegenwärtige Präsenz der beiden Amöben und Amöbe beständigen Bakterien in der Umwelt und am interessantesten in künstlichen Wassernetze, die als durch chemische Behandlungen wie Chlorung und Ozonierung gesteuert werden. Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind wesentliche Instrumente zu isolieren und kultiviere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Pr. Bernard La Scola für hilfreiche technische Ratschläge und interessante Diskussion über Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung. Wir danken auch Dr. Vincent Thomas für seine Hilfe bei der Umsetzung der Technik in unserem Labor.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

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Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

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