We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Etiquetado células ganglionares de la retina Como retrógradas (CGR) se pueden aislar CGR somata de sitios de morir, se ha convertido en el estándar de oro para el recuento de la CGR en la supervivencia de CGR y los experimentos de regeneración. Muchos estudios se han realizado en animales mamíferos para investigar la supervivencia de CGR después de la lesión del nervio óptico. Sin embargo, aún no se ha informado de marcado retrógrado de CGR en el pez cebra adultos, aunque algunos métodos alternativos pueden contar el número de células en capas de la retina de células ganglionares (RGCL). Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del cráneo adultos de pez cebra y el alto riesgo de muerte después de la perforación en el cráneo, se abre el cráneo con la ayuda de grabado ácido y sellar el agujero con una fianza de curado de luz, lo que podría mejorar significativamente la tasa de supervivencia. Después de absorber los colorantes durante 5 días, casi todos los CGR están etiquetados. Como este método no es necesario seccionar el nervio óptico, que es insustituible en la investigación de la supervivencia de CGR después del aplastamiento del nervio óptico en adultos de pez cebra. Aquí, presentamoseste método paso a paso y ofrecer resultados representativos.
Como adultos de pez cebra tiene una fuerte capacidad de regenerar axones después de la lesión del nervio óptico 1, un método adecuado para contar toda la CGR es fundamental para evaluar la supervivencia y regeneración de 2 CGR. Sobre la base de los métodos de la CGR etiquetado retrógradas en mamíferos y peces de colores 3-5, se construyó el método para etiquetar CGR del tectum en adultos de pez cebra. Para adultos de pez cebra, dos preocupaciones técnicos críticos deben tenerse en cuenta: el cráneo del pez cebra adulto es muy pequeño 6; viven en un ambiente de agua. Aquí, tratamos el cráneo con mordiente lo que minimiza los riesgos asociados con la perforación de 5. Luego, sellamos el agujero con la luz de bonos de curado que mejora la supervivencia de los animales después de la cirugía.
Anteriormente, se han adoptado varias otras técnicas para contar el número de CGR de manera indirecta. Tinción HE en las secciones de retina etiquetas de todos los tipos de células en el RGCL 7. Etiquetado de anticuerpos en toda la rEtina, tales como islote-1, también puede etiquetar células amacrinas 8. Aunque la etiqueta retrógrada del muñón del nervio óptico puede etiquetar todos los CGR en la retina, no se puede adoptar en el modelo de aplastamiento debido a que causa lesión adicional al nervio óptico. Aprovechando etiqueta retrógrada desde el tectum, hemos investigado la supervivencia y regeneración de la CGR en aplastamiento del nervio óptico. Los resultados muestran que casi todas las CGR y sobrevivieron más de 90% de CGR regeneran a la tectum en la primera semana en el modelo de aplastamiento 9.
Con el fin de etiquetar con éxito todas las CGR, pasta de Dil fue elegido después de la comparación con varios otros colorantes comerciales 10. En primer lugar, está especialmente diseñado para el etiquetado in vivo de tejidos. En segundo lugar, es un colorante lipófilo que no puede difundirse en agua. Además, esta fluorescencia puede persistir durante un largo tiempo que le hace un excelente candidato para la investigación de la supervivencia de CGR.
Marcado retrógrado de CGR es importante investigar la supervivencia de CGR en animales mamíferos, pero no se ha usado en el pez cebra. Los métodos alternativos, tinción HE 7 y 8 tinción de anticuerpos, no son normas de oro para contar el número de CGR, y las líneas transgénicas con todas las CGR marcadas aún no se ha construido el 12, 13. En este video, se introduce un método para retrogradar CGR etiqueta en la retina del pez cebra adulto. Aunque aproximadamente el 1% de los ax…
The authors have nothing to disclose.
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |