We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Rotulagem células ganglionares da retina como retrógrados (RGCs) pode isolar CGR somata de morrer locais, tornou-se o padrão-ouro para a contagem de CGR em CGR sobrevivência e experimentos de regeneração. Muitos estudos têm sido realizados em animais mamíferos para pesquisar CGR sobrevivência após a lesão do nervo óptico. No entanto, a marcação retrógrada de CGR em peixe-zebra adulto ainda não foi relatada, embora alguns métodos alternativos pode contar o número de células em camadas da retina células ganglionares (RGCL). Considerando o pequeno tamanho do crânio adulto zebrafish eo alto risco de morte após a perfuração no crânio, abrimos o crânio com a ajuda de condicionamento ácido e selar o buraco com um vínculo de cura luz, o que pode melhorar significativamente a taxa de sobrevivência. Depois de absorver os corantes, durante 5 dias, quase todos os CGR são rotulados. Como este método não precisa transecto o nervo óptico, é insubstituível na pesquisa de CGR sobrevivência após esmagamento do nervo óptico em peixe-zebra adulto. Aqui, apresentamoseste método passo a passo e fornecer resultados representativos.
Como adulto zebrafish tem uma forte capacidade de regenerar os axônios após a lesão do nervo óptico 1, um método apropriado para contar toda a CGR é essencial para avaliar CGR sobrevivência e regeneração 2. Baseado nos métodos de CGRs marcação retrógrada em mamíferos e peixes dourados 3-5, construímos o método para rotular CGRs do tectum em peixes-zebra adultos. Para o adulto zebrafish, duas preocupações técnicos críticos devem ser observados: o crânio de peixe-zebra adulto é muito pequena 6; eles vivem em um ambiente de água. Aqui, tratamos o crânio com etchant o que minimiza os riscos associados com a perfuração 5. Em seguida, selar o buraco com vínculo fotoativação que melhora a sobrevida dos animais após a cirurgia.
Anteriormente, foram adotadas diversas outras técnicas para contar o número CGR de forma indireta. Coloração HE nas secções de retina rótulos de todos os tipos de células no RGCL 7. Marcação de anticorpos em toda a retina, tais como ilhotas-1, também podem marcar células amacrine 8. Embora rótulo retrógrada do tronco do nervo óptico pode rotular todos os CGR na retina, não pode ser adotado no modelo de esmagamento porque provoca lesão extra para o nervo óptico. Aproveitando-se da etiqueta retrógrada do tectum, temos pesquisado CGR sobrevivência e regeneração no esmagamento do nervo óptico. Os resultados mostram que quase todas as CGRs sobreviveram e mais de 90% das CGR regenerado para o tectum na primeira semana de o modelo de esmagamento do 9.
Para rotular com sucesso todos os CGR, DII pasta foi escolhido após a comparação com vários outros corantes comerciais 10. Em primeiro lugar, é especialmente projetado para in vivo rotulagem tecido. Em segundo lugar, é um corante lipofílico que não se pode difundir na água. Além disso, essa fluorescência pode persistir por um longo período de tempo que o torna um excelente candidato para CGR investigação sobrevivência.
Marcação retrógrada das CGR é importante para a investigação CGRs sobrevivência em animais mamíferos, mas não tem sido usado em peixes-zebra. Os métodos alternativos, coloração HE 7 e coloração de anticorpos 8, não são padrões de ouro para a contagem número CGR e linhagens transgênicas com todos os CGRs marcadas ainda não foi construído 12, 13. Neste vídeo, apresentamos um método para retrógrado CGR rótulo na retina do peixe-zebra adulto. Apesar de cerca de 1% do…
The authors have nothing to disclose.
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |