Summary

Dois fótons de imagem de cálcio em camundongos Navegando um ambiente da realidade virtual

Published: February 20, 2014
doi:

Summary

Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.

Abstract

Nos últimos anos, dois fótons de imagem tornou-se uma ferramenta valiosa na neurociência, uma vez que permite a medição crônica da atividade de células geneticamente identificados durante comportamento 1-6. Aqui nós descrevemos métodos para realizar imagem de dois fótons em rato córtex enquanto o animal navega um ambiente de realidade virtual. Nós nos concentramos nos aspectos dos procedimentos experimentais, que são fundamentais para a imagem em um animal se comportar em um ambiente virtual iluminado. Os principais problemas que surgem nesta configuração experimental que nós aqui endereço são: minimizar artefatos de movimento do cérebro relacionada, minimizando luz vazamento do sistema de projeção de realidade virtual, e minimizando o dano tecidual induzida por laser. Nós também fornecemos software de amostra para controlar o ambiente de realidade virtual e fazer o acompanhamento dos alunos. Com estes processos e os recursos que deveria ser possível converter um microscópio de dois fotões convencional para uso em comportando ratinhos.

Introduction

Dois fótons de imagem de cálcio (indicadores geneticamente codificados como GCaMP5 7 ou R-GECO 8 ou corantes sintéticos como OGB ou Fluo4) emergiu como um poderoso método de medir a atividade neuronal em ratos comportando 1-6. Ele permite a medição simultânea da actividade de centenas de células de acção quase único potencial resolução, até cerca de 800 um abaixo da superfície do cérebro 9,10. Além disso, por meio de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) atividade neuronal pode ser medido cronicamente 5,11,12, e em tipos de células geneticamente definidas 13. Juntos, estes métodos proporcionam um grau de resolução temporal e espacial, que abre um grande número de novas possibilidades para o estudo de computação neuronal in vivo.

A intervenção cirúrgica é necessária para expor e rotular o cérebro do rato para a imagem latente. As células são tipicamente transfectados utilizando um recombinante vir adeno-associado nos sistema (AAV) para entrega GECI e uma janela craniana é implantado no local da injecção para ter acesso óptico ao cérebro. Uma barra de cabeça é então ligado ao crânio para fixação da cabeça sob o microscópio de dois fotões. A concepção e implementação dessas medidas é fundamental, como a maioria dos problemas com a imagem acordado surgem de instabilidades na preparação. Idealmente o procedimento descrito aqui deve permitir a imagem crônica de até vários meses após a cirurgia.

Para ativar o comportamento visualmente guiado durante dois fótons de imagem, o rato fixo cabeça fica em um ar apoiado esteira esférica, que ele pode usar para navegar em um ambiente de realidade virtual. Locomotion do mouse sobre a esteira é acoplado ao movimento no ambiente virtual que é exibido em uma tela toroidal em torno do 14,15 mouse. Variáveis ​​comportamentais, tais como locomoção, estímulo visual, e posição da pupila podem ser gravadas 6.

t "> Nós descrevemos os procedimentos envolvidos em dois fótons de imagem crônica em camundongos explorando um ambiente de realidade virtual Os principais pontos abordados são:. redução de artefatos de movimento, a redução do vazamento de luz, a maximização do número de células gravadas simultaneamente, e minimização de danos foto. Nós também fornecemos detalhes sobre como configurar a esteira apoiada pelo ar, controle de aluno eo ambiente de realidade virtual. Os procedimentos descritos aqui pode ser usado para geração de imagens de populações de células marcadas com fluorescência em camundongos fixos na cabeça em um potencialmente grande variedade de paradigmas comportamentais .

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as diretrizes do Departamento de Cantão Basel-Stadt Veterinária. 1. Hardware e Software Setup Dois fótons configuração microscópio de varredura: Use um laser infravermelho pulsado como fonte de iluminação (largura de pulso <120 FSEC). Use uma cabeça de leitura composto por um scanner de ressonância 8 ou 12 kHz e um padrão galvanometer Nota:. Isso pe…

Representative Results

A qualidade da imagem em dois fotões imagiologia de cálcio de populações de células marcadas com um GECI depende em grande parte a qualidade da janela craniana do implante. Duas semanas após a injeção do vírus da janela craniana devem ser inspecionados para maior clareza. Não deve haver nenhum tecido de granulação ou crescimento do osso visível (Figura 1A). Além disso, o padrão de vasos sanguíneos superficiais deverão permanecer inalterados e limites da vasculatura deve ser bem definida…

Discussion

A chave para o sucesso do comportamento de imagem de dois fotões é a estabilidade da preparação de duas maneiras:

  1. No decurso da implantação janela dias pós, as respostas inflamatórias do tecido pode conduzir a uma melhoria da formação de tecido de granulação e cartilagem que vai dificultar, ou mesmo impedir imagiologia.
  2. Durante o experimento, o cérebro tem que ser suficientemente estável para evitar artefatos de movimento a partir de corromper sinal de fluorescência atividade relaci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Friedrich Miescher de Pesquisa Biomédica, a Sociedade Max Planck, e do Programa Científico Fronteiras Humanas.

Materials

cover slips (d = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12kHz resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16x, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03  pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP  pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M  virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

References

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Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

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