Summary

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

Published: February 20, 2014
doi:

Summary

Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.

Abstract

Negli ultimi anni, l'imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l'animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l'imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l'indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l'ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.

Introduction

Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell'attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell'attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo.

È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l'imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l'accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l'attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l'imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l'imaging cronica fino a diversi mesi dopo l'intervento.

Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l'imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il 14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate 6.

t "> Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l'ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l'imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città. 1. Configurazione hardware e software Due fotoni configurazione microscopio a scansione: Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso <120 fsec). Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. <stro…

Representative Results

La qualità dell'immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l'iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito….

Discussion

La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi:

  1. Nel corso della finestra giorni dopo l'impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging.
  2. Durante l'esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.

Materials

cover slips (d = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12kHz resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16x, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03  pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP  pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M  virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

References

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Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

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