Summary

Deux photons Imaging calcium dans la souris Naviguer une réalité environnement virtuel

Published: February 20, 2014
doi:

Summary

Nous décrivons ici les procédures expérimentales impliquées dans l'imagerie à deux photons de cortex de la souris pendant le comportement dans un environnement de réalité virtuelle.

Abstract

Au cours des dernières années, l'imagerie à deux photons est devenu un outil précieux dans les neurosciences, car il permet de mesurer chronique de l'activité des cellules génétiquement identifiés lors de comportements 1-6. Nous décrivons ici les méthodes d'effectuer une imagerie à deux photons dans le cortex de la souris alors que l'animal navigue un environnement de réalité virtuelle. Nous nous concentrons sur les aspects des procédures expérimentales qui sont essentiels à l'imagerie chez un animal se comporter dans un environnement virtuel bien éclairée. Les principaux problèmes qui se posent dans ce dispositif expérimental que nous sommes ici adresse: minimiser les mouvements des artefacts liés au cerveau, en minimisant les fuites de lumière à partir du système de projection de la réalité virtuelle, et en minimisant induite par laser des lésions tissulaires. Nous fournissons également des logiciels de l'échantillon à contrôler l'environnement de réalité virtuelle et de faire le suivi des élèves. Avec ces procédures et les ressources, il devrait être possible de convertir un microscope à deux photons pour une utilisation conventionnelle en se comportant souris.

Introduction

Imagerie à deux photons des indicateurs de calcium (codés génétiquement comme GCaMP5 7 ou R-GECO 8, ou des colorants synthétiques comme OGB ou Fluo4) a émergé comme une puissante méthode de mesure de l'activité neuronale en comporter souris 1-6. Il permet la mesure simultanée de l'activité de plusieurs centaines de cellules à l'action quasi-unique résolution potentielle, jusqu'à environ 800 um en dessous de la surface du cerveau 9,10. En outre, en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) l'activité neuronale peut être mesurée de façon chronique 5,11,12, et dans des types cellulaires génétiquement déterminées 13. Ensemble, ces méthodes fournissent un degré de résolution temporelle et spatiale qui ouvrent une multitude de nouvelles possibilités dans l'étude de calcul neuronal in vivo.

Une intervention chirurgicale est nécessaire d'exposer et étiqueter le cerveau de la souris pour l'imagerie. Les cellules sont transfectées en utilisant typiquement un vir adéno-associé recombinant nous système (AAV) pour la livraison GECI et une fenêtre crânienne est implanté sur le site d'injection pour obtenir un accès optique au cerveau. Une barre de tête est ensuite fixé sur le crâne pour la tête de fixation sous le microscope à deux photons. La conception et la mise en œuvre de ces étapes est essentiel car la plupart des problèmes de l'imagerie éveillé découlent de l'instabilité dans la préparation. Idéalement, le procédé décrit ici devrait permettre l'imagerie chronique pouvant aller jusqu'à plusieurs mois après la chirurgie.

Pour activer le comportement guidé visuellement lors de l'imagerie à deux photons, la tête la souris fixe se trouve sur un tapis roulant sphérique de l'air pris en charge, qu'il peut utiliser pour naviguer dans un environnement de réalité virtuelle. Locomotion de la souris sur le tapis roulant est couplé au mouvement dans l'environnement virtuel qui s'affiche sur un écran toroïdal entourant le 14,15 de la souris. Variables comportementales telles que la locomotion, stimulus visuel, et la position de la pupille peuvent être enregistrées 6.

t "> Nous décrivons les procédures impliquées dans chronique imagerie à deux photons dans les souris d'explorer un environnement de réalité virtuelle Les principaux points abordés sont:. réduction des artefacts de mouvement, la réduction des fuites de lumière, la maximisation du nombre de cellules enregistrées simultanément, et la minimisation des dommages photo. Nous fournissons également des détails sur la mise en place du tapis de course gonflable, le suivi des élèves, et l'environnement de réalité virtuelle. Les procédures décrites ici peuvent être utilisés pour l'imagerie des populations de cellules marquées par fluorescence dans des souris fixes de la tête dans une potentiellement grande variété de paradigmes comportementaux .

Protocol

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés et mis en œuvre conformément aux lignes directrices du département vétérinaire du canton de Bâle-Ville. Une. Matériel et logiciel Setup Deux photons configuration balayage du microscope: Utiliser un laser infrarouge à impulsions comme source d'éclairage (de largeur d'impulsion <120 fs). Utilisez une tête de balayage composé d'un scanner de résonance 8 ou 12 kHz et un niveau galv…

Representative Results

La qualité de l'image en deux photons imagerie calcique de populations de cellules marquées avec un GECI dépend largement de la qualité de la fenêtre implant crânien. Deux semaines après l'injection du virus de la fenêtre crânienne doivent être inspectés pour plus de clarté. Il devrait y avoir aucun tissu de granulation ou de la repousse osseuse visible (Figure 1A). En outre, le motif de vaisseaux sanguins superficiels devrait rester inchangé et les limites du système vasculaire do…

Discussion

La clé du succès de comportement imagerie à deux photons est la stabilité de la préparation de deux façons:

  1. Au cours de la fenêtre de jours après l'implantation, les réponses inflammatoires du tissu peut conduire à l'amélioration de la formation du tissu de granulation et du cartilage qui va gêner ou même empêcher l'imagerie.
  2. Pendant l'expérience, le cerveau doit être suffisamment stable pour éviter les artefacts de mouvement de corrompre neuronal signal de fluores…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Institut Friedrich Miescher pour la recherche biomédicale, la Société Max Planck, et la Human Frontiers Science Program.

Materials

cover slips (d = 3-5 mm) Menzel window implant
InSight DeepSee laser Spectra-Physics microscope
12kHz resonance scanner Cambridge Technology G1-003-30026 microscope
Galvometer Cambridge Technology G6215H microscope
Digitizer National Instruments NI 5772 microscope
FPGA National Instruments PXIe 7965R microscope
Acquisition card National Instruments PCIe 6363 microscope
Emission filter 525/50 Semrock FF03-525/50-25 microscope
Piezo-electric z-drive Physikinstrumente P-726.1CD microscope
Controller for piezo-electric drive Physikinstrumente E665 LVPZT microscope
Objective 16x, 0.8NA Nikon CFI75 microscope
Current amplifier Femto DHPCA-100 microscope
Photomultiplier tube Hamamatsu microscope
USB Camera without IR filter ImagingSource DMK22BUC03  pupil tracking
Objective 50 mm ImagingSource M5018-MP  pupil tracking
Macro adapter rings ImagingSource LAexSet pupil tracking
Optical computer mouse Logitech G500 motion tracking
Styrofoam ball 20 cm e.g. idee-shop.de 08797.00.15 virtual environment
LED projector Samsung SP-F10M  virtual environment
Acquisition card National Instruments NI 6009 virtual environment
Panda3D game engine www.panda3d.org virtual environment
Numpy library for Python www.scipy.org virtual environment
Scipy library for Python www.scipy.org virtual environment
NI-DAQmx driver National Instruments www.ni.com virtual environment
Ultrasound gel Dahlhausen 5701.0342.10 imaging

References

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Leinweber, M., Zmarz, P., Buchmann, P., Argast, P., Hübener, M., Bonhoeffer, T., Keller, G. B. Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment. J. Vis. Exp. (84), e50885, doi:10.3791/50885 (2014).

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