Met Click Chemie aan het effect van de virale infectie Meet op Host-cel RNA Synthese
Summary
Deze methode beschrijft het gebruik van klikchemie op veranderingen in gastheercel transcriptie meten na infectie met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12. De resultaten kunnen worden gevisualiseerd kwalitatief via fluorescentie microscopie of verkregen kwantitatief via flowcytometrie. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik met andere virussen.
Abstract
Veel RNA virussen zijn geëvolueerd de mogelijkheid gastheercel transcriptie remmen als middel om cellulaire afweer omzeilen. Voor de studie van dergelijke virussen, is het daarom belangrijk om een snelle en betrouwbare manier van meten transcriptionele activiteit in geïnfecteerde cellen. Traditioneel is transcriptie ofwel is gemeten door incorporatie van radioactieve nucleosiden zoals 3H-uridine gevolgd door detectie via autoradiografie of scintillatietelling, of opname van gehalogeneerde uridine analogen zoals 5-bromouridine (BRU) gevolgd door detectie door immunokleuring. Het gebruik van radioactieve isotopen, vereist echter speciale apparatuur en niet haalbaar in een aantal laboratoria instellingen waarbij de detectie van bru omslachtig kan zijn en lijden aan lage gevoeligheid.
De chemie recent ontwikkelde klik, dat een koper-gekatalyseerde triazool vorming van een azide en een alkyn gaat, biedt nu een snelle en highly gevoelig alternatief voor deze twee methoden. Klikchemie is een tweestaps werkwijze waarbij ontluikende RNA wordt eerst gemerkt door incorporatie van de analoge uridine 5-ethynyluridine (EU), gevolgd door detectie van de label een fluorescent azide. Deze aziden zijn beschikbaar als verschillende fluoroforen, waardoor een breed scala van opties voor visualisatie.
Dit protocol beschrijft een methode om transcriptionele onderdrukking te meten in cellen geïnfecteerd met het Rift Valley fever virus (RVFV) stam MP-12 met behulp van click chemie. Tegelijkertijd wordt de expressie van virale proteïnen in deze cellen bepaald door klassieke intracellulaire immunokleuring. Stappen 1 tot 4 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking visualiseren via fluorescentie microscopie, terwijl stap 5 tot 8 detail van een methode om transcriptionele onderdrukking kwantificeren via flowcytometrie. Dit protocol is eenvoudig aanpasbaar voor gebruik met andere virussen.
Introduction
Traditioneel is transcriptionele activiteit werd gemeten door incorporatie van zowel radioactieve (3H-uridine) 1 of gehalogeneerde (BRU) 2 nucleosiden in ontluikende RNA. Deze uridine analogen worden door cellen, omgezet in uridine-trifosfaat (UTP) via nucleoside salvage pathway, en vervolgens opgenomen in nieuw gesynthetiseerde RNA. 3H-uridine kan worden gedetecteerd door autoradiografie, die tijdrovend of scintillatie tellen, die gespecialiseerde apparatuur vereist. Bovendien kan het gebruik van radioactieve isotopen niet praktisch zijn in een aantal laboratoria instellingen, waaronder high containment biosafety laboratoria. Bru kan worden gedetecteerd door immunokleuring met anti-bru antilichamen die hard permeabilisatie noodzakelijk kunnen de toegang van het antilichaam aan de kern of gedeeltelijke denaturatie van RNA, zoals RNA secundaire structuur kan een sterische hindering voor antilichaambinding te verzekeren.
_content "> De hier beschreven protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde chemie op 3 om transcriptionele activiteit te meten in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12. Instructies chemie gebaseerd op een zeer selectieve en efficiënte koper (I)-gekatalyseerde cycloadditie reactie tussen een alkyn en een azide groep 4,5. In dit protocol ontluikende RNA in geïnfecteerde cellen wordt eerst gemerkt door incorporatie van de uridine analoge EU. In een tweede stap wordt het opgenomen EU gedetecteerd door reactie met een fluorescerende azide. De belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn (1) dat zij niet het gebruik van radioactieve isotopen vereisen en (2) dat het niet hard permeabilisatie of denaturatie van RNA vereisen. met een molecuulgewicht van minder dan 50 Da, toegang van de fluorescerende azide wordt niet belemmerd door onvoldoende permeabilisatie of RNA secundaire structuur. Bovendien zijn de onderzoekers niet beperkt in hun keuze van primaire antilichamen bij het combineren van de detectie van RNA met een klasical immunostaining voor virale eiwitten.Twee verschillende werkwijzen zijn in dit protocol: een voor visualiseren transcriptie via fluorescentiemicroscopie (stappen 1-4), en een voor het kwantificeren transcriptie door flowcytometrie (stappen 5-8). Beide methoden combineren coderen van ontluikende RNA met intracellulair immunokleuring voor virale eiwitten, die zorgt voor een verband tussen transcriptionele activiteit en virale infectie van een cel per cel basis.
De auteurs hebben met succes het protocol beschreven om transcriptionele activiteit te bepalen in cellen geïnfecteerd met de stam RVFV MP-12 6, cellen geïnfecteerd met verschillende MP-12 mutanten 7,8, 9 en cellen geïnfecteerd met virus Toscana (TOSV) 10. De hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met verschillende virussen en heeft het potentieel om te worden aangepast om immunofluorescentie kleuring van specifieke virale of cellulaire eiwitten omvatten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocol beschrijft een methode om het effect van virale infecties aan gastheercel transcriptie gemeten via incorporatie van de uridine analoge EU in wording RNA. Deze werkwijze heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden: het is snel, gevoelig, en niet afhankelijk van het gebruik van radioactieve isotopen. Verder kan de werkwijze worden aangepast om kwalitatieve gegevens opleveren door fluorescentiemicroscopie of kwantitatieve gegevens via stroomcytometrie door toepassing van vrijwel dezelfde rea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken RB Tesh voor het verstrekken van de muis polyklonale anti-RVFV antiserum en M. Griffin van de UTMB flowcytometrie Core Facility voor hulp bij flowcytometrie. Dit werk werd ondersteund door 5 U54 AI057156 via de Western Regional Center of Excellence, NIH-subsidie R01 AI08764301, en de financiering van de Sealy Center for Vaccine Development bij UTMB.BK werd gesteund door de James W. McLaughlin Fellowship Fund op UTMB.OL werd ondersteund door een Maurice R. Hilleman Early-Stage Career Investigator Award.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
